S印harose層析柱（1. 6cmX20cm)，備用。取PHA粗提物10g，用上述平衡 液溶解，以l〇〇〇〇r/min離心15min，上清夜用于DEAE-Sepharose離子交換層析，然后以 15mmolNa2HP04(pH6.5)平衡液洗柱，276nm波長檢測，待穿透峰全部流出后，并改用15mmol Na2HP04(內(nèi)含50mmol/LNaCl，pH6. 5)的清洗緩沖液進(jìn)行清洗，流速為5ml/min。再用15mmol Na2HP04(內(nèi)含90mmol/LNaCl，pH6. 5)的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為5ml/min，收集洗脫 峰，即為PHA-L溶液。所得的PHA-L純度大于95% (見圖1的2號泳道），含量用276nm波 長測定（純化的PHA-L對應(yīng)的毫克消光系數(shù)為1. 174)。
[0031](三）10L無血清淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基的配制：
[0032] 加RPMI1640干粉10升量（104.0g，含谷氨酰胺3g，來自GIBC0公司）至5.0L超 純水中，攪拌澄清后依次加入碳酸氫鈉（AR級）20g、氨基酸母液（50X)200mL、牛血清白蛋白 (MP公司、干細(xì)胞培養(yǎng)級）40g，重組人胰島素（大腸桿菌重組表達(dá)，來自LIFE公司）100mg、 檸檬酸鐵1〇11^，？擬-120〇11^。加入超純水至9.51左右，其后加入說11(：1調(diào)？11值至7.2 并加超純水定容至于10. 0L。0. 2umPVDF濾膜過濾除菌，分裝于20mL西林瓶中（5. 0ml/ 瓶），-20°C貯存?zhèn)溆谩?br>[0033] 比較實(shí)驗(yàn)
[0034] 本發(fā)明的無血清外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基與傳統(tǒng)的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)效 果比較。
[0035] 傳統(tǒng)的含小牛血清的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基按表1進(jìn)行配制，其中RPMI1640同實(shí)例3， 新生小牛血清來源于杭州四季青公司。過濾后培養(yǎng)基用〇.2umPVDF濾膜過濾除菌，分裝于 20mL西林瓶中（5. 0ml/瓶），-20°C貯存?zhèn)溆谩?br>[0036] 按以下方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)效果檢測：
[0037] (1)在無菌操作工作臺上，加1. OmL人外周血至含5mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中；
[0038] (2)將樣品混勾，置37°C恒溫箱中培養(yǎng)約72小時，每24小時輕輕搖晃一次培養(yǎng) 瓶；
[0039] (3)培養(yǎng)結(jié)束前2-4小時前加入秋水仙酰胺至終濃度為0.5ug/mL;
[0040] (4)將細(xì)胞懸液加入10mL離心管，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；
[0041] (5)去上清，留細(xì)胞團(tuán)；
[0042] (6)低滲：加入 37°C0? 075MKC1 4-6ml，吸管吹打，37°C水浴 3-5 分鐘；
[0043] (7)預(yù)固定：加入1. 5mL甲醇：冰醋酸=3 :1的固定液，輕輕混勾，37°C水浴5分 鐘，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。去上清約留0. 5mL;
[0044] (8)固定：加入固定劑8mL，37°C水浴5分鐘，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。去上 清約留0. 5mL;
[0045] (9)重復(fù)步驟⑶一次，其后1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去上清，視管底細(xì)胞量加 入適當(dāng)幾滴固定劑；
[0046] (10)滴片、烤片：每片1-2滴，75°C烘烤3小時；
[0047] (11)GIEMSA染色后檢測淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和分裂相比例。
[0048] 表1傳統(tǒng)含小牛血清的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基配方（5L)
[0049]
[0050]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，包括凝集素、基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及 血清替代物，所述凝集素為L型植物血球凝集素，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 所述血清替代物包括牛血清白蛋白、重組人胰島素、檸檬酸鐵和氨基酸母液。
2. 如權(quán)利要求1所述的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，包括如下組 分： RPMT1 640 培養(yǎng)基千粉 10.4 g/L, 碳酸氫納 2. 0 g/L， 牛血清白蛋白 4. 0 g/L， L型植物血球凝集素 20 mg/L, 氨基酸母液 20 ml/L， 梓檬酸鐵 lmg/L, 重組人胰島素 10 mg/L。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述氨基 酸母液包括L-谷氨酸、L-甘氨酸和L-天冬氨酸。
4. 如權(quán)利要求3所述的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，氨基酸母液 中L-谷氨酸的濃度為300mg/L，L-甘氨酸的濃度為100mg/L，L-天冬氨酸的濃度為400mg/ L0
5. 如權(quán)利要求1或2所述的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述牛血 清白蛋白的純度不低于98%。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述L型 植物血球凝集素為來自紅腰子豆的具有刺激T淋巴細(xì)胞有絲分裂的凝集素類糖蛋白組分。
7. 如權(quán)利要求6所述的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述L型植物 血球凝集素的純度不小于95%。
8. 如權(quán)利要求1或2所述的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述重組 人胰島素是使用酵母或大腸桿菌為工程菌生產(chǎn)出來的藥用級的胰島素。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物制劑，尤其涉及一種淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基。其包括凝集素、基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及血清替代物，所述凝集素為L型植物血球凝集素，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述血清替代物包括牛血清白蛋白、重組人胰島素、檸檬酸鐵和氨基酸母液。本發(fā)明的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基不用動物或人血清，這樣可以不僅可以降低培養(yǎng)基成本，還可以降低傳播疾病的風(fēng)險；本發(fā)明的無血清人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基所用組分確定，避免了傳統(tǒng)血清成分復(fù)雜，不同批次間具有質(zhì)量差異，而導(dǎo)致培養(yǎng)效果波動的問題；本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)基淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率與淋巴細(xì)胞分裂指數(shù)高，試劑成本低、質(zhì)量穩(wěn)定，培養(yǎng)的細(xì)胞可用于染色體核型分析的臨床診斷。
【IPC分類】C12N5-0783, C12N5-0781
【公開號】CN104830766
【申請?zhí)枴緾N201510268603
【發(fā)明人】周海軍, 吳家波, 張邦驟
【申請人】廣州和能生物科技有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月22日