用于唐氏綜合癥產(chǎn)前診斷的生物標志物的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年9月26日遞交的新加坡專利申請第201207172-6號的優(yōu)先 權權益，其完整內(nèi)容通過引用并入本文中，用于所有目的。
技術領域
[0003] 本發(fā)明涉及生物化學，特別是生物標志物/生物標志物區(qū)域。具體而言，本發(fā)明涉 及與唐氏綜合癥相關的生物標志物/生物標志物區(qū)域以及使用所述生物標志物確定胎兒 患唐氏綜合癥的可能性的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005]目前用于篩查胎兒先天性疾病的方法包括超聲如胎兒頸項透明層（NT)和其他檢 測母體血清中發(fā)現(xiàn)的生物標志物的檢驗。例如，在唐氏綜合癥的篩查中，測量的生物標志 物包括胎兒和胎盤產(chǎn)生的并且可以在母體血清中檢測到的a甲胎蛋白（AFP)和人絨膜促 性腺激素的量。連同母親的年齡及胎兒頸項透明層掃描的結(jié)果，a甲胎蛋白和人絨膜促性 腺激素的測量值被用于計算嬰兒患唐氏綜合癥的風險。當?shù)玫降臄?shù)值風險被歸類為高風險 時，為了證實結(jié)果，利用絨毛膜絨毛取樣（CVS)或羊膜穿刺術以獲得胎兒組織的侵入性檢 驗是需要的。由于絨毛膜絨毛取樣或羊膜穿刺術包括插入細針至子宮中，這些方案可能造 成流產(chǎn)。
[0006] 唐氏綜合癥或蒙古癥是由于染色體缺陷造成的先天性病況。生下來就患有唐氏綜 合癥的個體的染色體21具有3個拷貝，而非是通常的2個，因此使得該疾病也被稱為21三 體。
[0007] 唐氏綜合癥的原因還不清楚，并且還未確定直接的基因型-表型關聯(lián)。然而，發(fā)現(xiàn) 某些條件如較大的母體年齡及有患唐氏綜合癥的另外的孩子或先前的懷孕史能增加懷患 唐氏綜合癥胎兒的風險。由于患唐氏綜合癥的個體將發(fā)展復雜的臨床特征和癥狀如終身智 力遲鈍、發(fā)育遲緩以及其他問題如癲癇、甲狀腺病癥、心臟缺陷、增加的白血病風險、不孕、 胃腸缺陷和早衰，需要提供患21三體胎兒的精確檢測。
[0008] 由于目前篩查標志物提供了低特異性，并且可靠的篩查方法依賴于通過羊膜穿刺 或絨毛膜絨毛采集樣本來收集羊水，需要提供可用于篩查胎兒疾病的替代方法或生物標志 物。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 在一方面，提供了分離的生物標志物/生物標志物區(qū)域，其包含選自表3-6(組3、 4、1'和2')任一個中列出的DNA區(qū)域的人類基因組DNA區(qū)域。
[0011] 在另一方面，提供了用于檢測21三體或部分21三體的分離的生物標志物/生物 標志物區(qū)域，其包含選自表3-6(組3、4、1'和2')任一個中列出的DNA區(qū)域的人類基因 組DNA區(qū)域。
[0012] 在另一方面，提供了分離的生物標志物/生物標志物區(qū)域，其包含選自表1-4及表 7-8 (分別為組1-4及MixlO組1和MixlO組2)任一個中列出的DNA區(qū)域的人類基因組DNA 區(qū)域，其中患病的樣本中的生物標志物/生物標志物區(qū)域任何一種的DNA甲基化水平不同 于未患病對照DNA的相同生物標志物/生物標志物區(qū)域中的DNA甲基化水平。
[0013] 在另一方面，提供了確定胎兒患特定疾病的可能性的方法。所述方法包括以下步 驟：a)提供來自孕婦的分離的總DNA樣本，其包含胎兒DNA和母體DNA。還包括以下步驟： b)去除母體DNA背景；c)基于一種或多種生物標志物/生物標志物區(qū)域，測量指示胎兒DNA 水平的信號，其中在母體DNA背景具有小于10%的甲基化水平的情況下，信號為甲基化的 胎兒DNA水平，并且在母體DNA背景具有大于90%的甲基化水平的情況下，信號為未甲基化 的胎兒DNA水平；d)通過將組1和/或組3生物標志物/生物標志物區(qū)域中一種或多種的 信號除以組2和/或組4生物標志物/生物標志物區(qū)域中一種或多種的信號，確定根據(jù)步 驟c)得到的信號的比值，其中比值大于在獲自未患病胎兒的對照胎兒DNA中確定的比值指 示所述胎兒可能患有特定疾病。在一個實例中，每個組的特征為：
[0014] 組1 :母體DNA背景具有小于10%的甲基化水平，并且獲自患特定疾病胎兒的胎兒 DNA中的生物標志物/生物標志物區(qū)域相比獲自未患該疾病的胎兒的對照胎兒DNA中的相 同生物標志物/生物標志物區(qū)域，其信號更高。
[0015] 組2 :母體DNA背景具有小于10%的甲基化水平，并且獲自患特定疾病胎兒的胎兒 DNA中的生物標志物/生物標志物區(qū)域相比獲自未患該疾病胎兒的對照胎兒DNA中的相同 生物標志物/生物標志物區(qū)域，其信號更低。
[0016] 組3 :母體DNA背景具有大于90%的甲基化水平，并且獲自患特定疾病胎兒的胎兒 DNA中的生物標志物/生物標志物區(qū)域相比獲自未患該疾病胎兒的對照胎兒DNA中的相同 生物標志物/生物標志物區(qū)域，其信號更高。
[0017] 組4:母體DNA背景具有大于90%的甲基化水平，并且獲自患特定疾病胎兒的胎兒 DNA中的生物標志物/生物標志物區(qū)域相比獲自未患該疾病胎兒的對照胎兒DNA中的相同 生物標志物/生物標志物區(qū)域，其信號更低。
[0018] 在又一個方面，提供了確定胎兒患21三體或部分21三體的可能性的方法。所述 方法包括以下步驟：a)提供來自孕婦的分離的總DNA樣本，其包含胎兒DNA和母體DNA;b) 去除母體DNA背景；c)基于表1-8中任一個列出的一種或多種生物標志物/生物標志物區(qū) 域，測量指示胎兒DNA水平的信號，其中在母體DNA背景具有小于10%的甲基化水平的情況 下，信號為甲基化的胎兒DNA水平，以及在母體DNA背景具有大于90%的甲基化水平的情 況下，信號為未甲基化的胎兒DNA水平；d)通過將組1和/或組3生物標志物/生物標志 物區(qū)域的一種或多種的信號除以組2和/或組4生物標志物/生物標志物區(qū)域的一種或多 種的信號，確定根據(jù)步驟c)獲取的信號的比值，其中比值高于獲自未患病胎兒的對照胎兒 DNA中確定的比值，指示該胎兒很可能患有21三體或部分21三體。在一個實例中，每個組 的特征為：
[0019] 組1 :表1(組1)、表5(組1'）或表7(MixlO組1)中列出的生物標志物/生物標 志物區(qū)域。
[0020] 組2 :表2 (組2)或表6 (組2'）或表8 (MixlO組2)中列出的生物標志物/生物 標志物區(qū)域。
[0021] 組3 :表3中列出的生物標志物/生物標志物區(qū)域（組3)。
[0022] 組4 :表4中列出的生物標志物/生物標志物區(qū)域（組4)。
[0023] 在又一個方面，提供了試劑盒，其包含用于擴增選自表3-6(組3、4、1'和2')任 一個中列出的人類基因組DNA區(qū)域的任一個的一種或多種生物標志物/生物標志物區(qū)域的 引物。所述試劑盒還包含一種或多種試劑，其用于基于一種或多種生物標志物/生物標志 物區(qū)域測量指示胎兒DNA水平的信號。
[0024] 在又一個方面，提供了試劑盒，其包含用于擴增選自表1_4(組1-4)任一個中列出 的人類基因組DNA區(qū)域的任一個的一種或多種生物標志物/生物標志物區(qū)域的引物。所述 試劑盒還包含一種或多種試劑，其用于基于一種或多種生物標志物/生物標志物區(qū)域，測 量指示胎兒DNA水平的信號。
[0025] 在又一個方面，提供了試劑盒，其包含用于擴增選自表7-8(MixlO組1和MixlO組 2)任一個中列出的人類基因組DNA區(qū)域的任一個的一種或多種生物標志物/生物標志物區(qū) 域的引物。所述試劑盒還包含一種或多種試劑，其用于基于一種或多種生物標志物/生物 標志物區(qū)域測量指示胎兒DNA水平的信號。
[0026] 在又一個方面，提供了確定生物標志物/生物標志物區(qū)域的甲基化水平的方法， 包括以下步驟：a)用差異化修飾甲基化的和未甲基化的DNA的試劑處理包含胎兒和母體 DNA的樣本。所述方法還包括b)計算未修飾的胞喃啶殘基相比修飾的和未修飾的胞喃啶殘 基的總數(shù)的百分比，以確定生物標志物/生物標志物區(qū)域的甲基化水平。
【附圖說明