】
[0027] 當結(jié)合非限制性實例和附圖考慮時，參照詳細描述將能更好地理解本發(fā)明。
[0028] 圖1:借以使用甲基化生物標志物進行21三體（T21)胎兒檢測的實施例2中進行 的步驟的示意圖。該步驟在說明書中有詳細的解釋。通過使用通用qPCR引物對和組特異 性探針定量胎兒特異性DNA，進行這些步驟的結(jié)果在21三體胎兒和正常胎兒之間不同。如 果組1與組2之間的比值高，則該胎兒被認為是21三體；如果該比值低，則該胎兒被認為是 正常的。組特異性探針根據(jù)表7和8定義。圖1示出了應(yīng)用本公開的方法確定胎兒患21 三體的可能性的一個實例。
[0029] 圖2:利用探針MixlO的組1和組2生物標志物之間的信號差異。該柱狀圖示出了 來自利用組1和組2生物標志物對21三體（T21)和正常樣本進行的DNA分析的數(shù)據(jù)。此 處示出的差異為使用探針MixlO時的21三體和正常組之間的不同甲基化的結(jié)果，所述探針 MixlO包含35種來自組1的生物標志物和26種來自組2的生物標志物。探針序列及其靶 標生物標志物的詳細信息列出在MixlO組1(參見表7)和MixlO組2 (參見表8)中。因此， 圖2顯示了可從本公開的方法獲取的示例性數(shù)據(jù)，其表明獲自21三體的樣本明顯不同于獲 自正常個體的樣本。
[0030] 圖3 :使用探針MixlO的正常和21三體（T21)胎兒DNA之間的信號差異。此處， 該柱狀圖顯示了 21三體和正常組織之間的信號強度的差異。示出了來自探針MixlO的 AACt(組2-組1)值，其在正常和21三體組織之間的甲基化差異在測試的探針混合物的 所有組合中最大。因此，圖3顯示了在獲自使用本公開的生物標志物/生物標志物區(qū)域分 析的樣本的信號中觀察到的明顯差異。
[0031] 圖4 :關(guān)于探針MixlO的靈敏度評估，顯示了具有不同濃度的加入（spiked)胎兒 DNA的⑷ACt(組2 -組1)和⑶AACt(組2 -組1)。加入有21三體（T21)胎盤DNA 的樣本（模擬來自懷有21三體胎兒的孕婦母體血漿樣本）明顯不同于加入有正常CVSDNA的樣本（模擬來自懷有非21三體胎兒的孕婦的母體血漿樣本）。因此，圖4示出了用于檢 測本公開的生物標志物/生物標志物區(qū)域的探針的靈敏度。
[0032] 圖5:檢測母體血漿中甲基化的基因組DNA信號。（A)圖示出了一維散點圖，其代 表所檢測的生物標志物中的DNA甲基化水平。（B)示出了另一散點圖，這次描述了來自母體 血漿樣本的組1和組2的甲基化比值。這一比較顯示了 21三體（T21)樣本相比正常樣本 中組1和組2的甲基化比值的較高值。因此，圖5表明獲自21三體樣本的本公開的生物標 志物/生物標志物區(qū)域的DNA甲基化水平顯著不同于獲自非21三體樣本（正常）的樣本 的DNA基化水平。
[0033] 表格說明
[0034] 表A顯示了將不同的生物標志物/生物標志物區(qū)域歸類為組1-4。
[0035] 表B顯示了獲自正常絨毛膜絨毛樣本相比21三體絨毛膜絨毛樣本或胎盤的DNA 的DNA甲基化。
[0036] 表C顯示了獲自21三體絨毛膜絨毛樣本或胎盤相比正常絨毛膜絨毛樣本的DNA 的DNA甲基化。
[0037] 表1列出了落入如本文所述的組1的生物標志物/生物標志物區(qū)域。
[0038] 表2列出了落入如本文所述的組2的生物標志物/生物標志物區(qū)域。
[0039] 表3列出了落入如本文所述的組3的生物標志物/生物標志物區(qū)域。
[0040] 表4列出了落入如本文所述的組4的生物標志物/生物標志物區(qū)域。
[0041] 表5列出了落入如本文所述的組1'的生物標志物/生物標志物區(qū)域。
[0042] 表6列出了如本文所述的落入組2'的生物標志物/生物標志物區(qū)域。
[0043] 表7列出了如本文所述的落入MixlO組1的生物標志物/生物標志物區(qū)域。
[0044] 表8列出了如本文所述的落入MixlO組2的生物標志物/生物標志物區(qū)域。
[0045]發(fā)明詳述
[0046] 本公開的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)取決于生物標志物/生物標志物區(qū)域，胎兒DNA和母體DNA 中的DNA甲基化水平可以不同，使得差異可被用于區(qū)分（1)母體DNA與胎兒DNA，以及（2) 來自有或無病況或疾病的胎兒的胎兒DNA。如本文所用，術(shù)語"疾病"和"病況"可互換使用， 是指不被認為是基準、正常或健康的病況。在一個實例中，所述疾病或病況為唐氏綜合癥或 21三體。如本文所用，"DNA甲基化"是指添加甲基至DNA序列中的胞嘧啶或腺嘌呤核苷酸 中。術(shù)語"母體DNA"是指獲自胎兒的母親或子宮中攜帶有胎兒的個體的DNA或多核苷酸。 在一個實例中，母體DNA可包括但不限于獲自組織或細胞樣本的母體DNA以及母體外周血 DNA。相反，術(shù)語"胎兒DNA"是指獲自胎兒或疑似患有病況或疾病的個體的DNA或多核苷 酸。
[0047] 例如，當母體血液DNA為接近零甲基化時，甲基化敏感性酶可用于消化母體DNA， 從而分離完整的甲基化的胎兒DNA用于進一步分析。短語"零甲基化"是指觀察到基本上沒 有或約1 %、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%或約10%的甲基化。 相反，當母體血液DNA中的區(qū)域為高度甲基化時，甲基化依賴性酶可被用于消化母體DNA， 從而分離完整的未甲基化的胎兒DNA用于進一步分析。短語"高度甲基化的"是指完全、基 本上完全或接近100%的甲基化或約100%、約99%、約98%、約97%、約96%、約95%、約 94%、約93%、約92%或約90%的甲基化。在以甲基化母體DNA中觀察到的程度去除母體DNA后，然后分析分離的胎兒DNA的DNA甲基化水平。本公開的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)相比無病況或疾 病的胎兒，從患病況或疾病的胎兒分離的胎兒DNA通常為差異化甲基化的。
[0048] 因此，公開了確定生物標志物/生物標志物區(qū)域的甲基化水平的方法。所述方法 可包括以下步驟：a)用差異化修飾甲基化的和未甲基化的DNA的試劑處理包含胎兒和母體DNA的樣本。所述方法還可包括：b)計算未修飾的胞喃啶殘基相比修飾的和未修飾的胞喃 啶殘基的總數(shù)的百分比，以確定生物標志物/生物標志物區(qū)域的甲基化水平。例如，所述試 劑可包括但不限于亞硫酸氫鈉、一種或多種僅切割甲基化的DNA的酶如甲基化依賴性酶， 以及一種或多種僅切割未甲基化的DNA的酶如甲基化敏感性酶。確定如本文公開的生物標 志物/生物標志物區(qū)域的甲基化水平的方法還可包括亞硫酸氫鹽測序步驟，其可在計算未 修飾的胞嘧啶殘基的百分比的步驟（即，如本文所述的方法的步驟（b))之前進行。亞硫酸 氫鹽測序步驟可為簡化的代表性亞硫酸氫鹽測序（RRBS)，其被用于定量來自正常個體或患 有疾病或病況的個體的胎盤樣本的全基因組DNA甲基化特性。從亞硫酸氫鹽測序步驟，比 較了從未修飾的胞嘧啶殘基和修飾的胞嘧啶殘基檢測到的信號以計算甲基化水平。
[0049] 確定生物標志物/生物標志物區(qū)域的甲基化水平的方法為本公開提供篩選唐氏 綜合癥的生物標志物/生物標志物區(qū)域的方法的目標作了準備。術(shù)語"21三體"可與"唐 氏綜合癥"互換使用，并且如本文中所用是指這樣的狀態(tài)，其中個體或?qū)ο蠡蛱旱暮诵偷?特征為人類21染色體（HSA21)的完全或部分的三倍性。當個體或?qū)ο蠡蛱壕哂腥祟惾?色體21的部分三倍性時，該個體將被認為是部分21三體。21三體引起復(fù)雜的臨床特征和 癥狀，例如智力遲鈍、阿爾茲海默病、癲癇、甲狀腺失調(diào)癥、心臟缺陷、增加的白血病風(fēng)險、不 孕、胃腸缺陷和早衰的。
[0050] 當疾病或病況為唐氏綜合癥時，可以基于以下步驟選擇差異化甲基化的區(qū)域。第 一，可以選擇個別的CpG位點。每個CpG位點的甲基化水平可計算為：
[0051]CpG的甲基化水平=胞嘧啶計數(shù)八胞嘧啶計數(shù)+胸腺嘧啶計數(shù)）*100%。
[0052] 可使用以下標準選擇個別CpG位點：
[0053] 1)存在于至