與小麥株高相關的TaGS2基因的分子標記、獲取方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物基因工程技術領域，具體地說是一種與小麥株高相關的塞 因的分子標記、獲取方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 小麥是世界上最重要的糧食作物，也是我國三大糧食作物之一。株高是影響小麥 高產(chǎn)的重要因素，植株過高的品種在高肥水條件下容易發(fā)生倒伏，導致產(chǎn)量下降；植株過矮 易使葉片擁擠，中下部通風透光不良，導致光合效率及產(chǎn)量降低。20世紀60-80年代，矮桿 和半矮桿小麥品種的推廣，對全世界小麥產(chǎn)量的提高起到了關鍵作用。除受主效矮桿基因 控制外，小麥株高性狀還表現(xiàn)為受其他多個基因控制的性狀特征。
[0003] 植物合成氨基酸時，谷氨酰胺合成酶（GS)和谷氨酸合酶（G0GAT)催化合成谷氨酰 胺和谷氨酸，這兩種氨基酸是所有含氮化合物的主要氮素供體，在氨基酸合成途徑中居于 重要的位置，而GS的催化能力能夠影響作物的產(chǎn)量潛力（Habash et al.，2007)。
[0004] 分子標記輔助育種是一種采用與特定性狀相關聯(lián)的分子標記作為輔助手段進行 育種的有效方法，具有不受環(huán)境條件限制、在植物發(fā)育的各個組織和生育時期均可檢測、選 擇效率高等優(yōu)勢。隨著基因組學的研宄進入功能基因組學時代，突變體的作用受到了越來 越多學者的關注。構建突變體庫是分析基因功能的方法之一，利用合適的誘變方法構建突 變體庫，豐富種質資源，鑒定基因功能是得知該基因功能最直接和有效的方法。因此，研宄 調控株尚的基因，獲得與株尚基因相關聯(lián)的分子標記，利用該分子標記對小麥株尚相關基 因進行定位和檢測，有效調控小麥的株高類型，選育預期株高類型的小麥新品種，塑造合理 的株高發(fā)生群體，對提高小麥群體質量和產(chǎn)量具有極其重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種與小麥株高相關的基因的分子標記、獲取方法及 其應用，以利用該分子標記對小麥株高基因進行定位和檢測，在小麥選育中對其親 本進行有目的地選擇，為選育目標株高類型的小麥新品種提供了指導依據(jù)。
[0006] 本發(fā)明是通過以下方法實現(xiàn)的：一種與小麥株高相關的基因的分子標記， 該分子標記為IN10,所述分子標記IN10的上游引物核苷酸序列如SEQ ID N0 : 1所示、下 游引物核苷酸序列如SEQ ID N0 : 2所示，以所述分子標記IN10的標記引物對小麥基因組 DNA進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物電泳分離，獲得對應的擴增產(chǎn)物分子量分別為555bp、466bp 和426bp，即為與小麥株高相關的TaGS2基因的分子標記。
[0007] 所述PCR擴增的體系為20 y 1，包括：2XTaq PCR MasterMix 10y 1，上、下游引 物各1 y 1，DNA模板1 y 1，其余為ddH20。
[0008] 所述PCR擴增的程序為：94°C預變性5 min ;94°C變性30 s，56°C退火30 s，72°C 延伸1 min/kb，30個循環(huán)；72°C后延伸7 min ;20°C保存。
[0009] 本發(fā)明與小麥株高相關的基因的分子標記的獲得方法，包括以下步驟： (a) 提取六倍體小麥科農(nóng)9204三葉期幼苗總RNA，設計擴增引物為：上游引物核苷酸序 列如SEQ ID N0 : 3所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID N0 : 4所示，采用RT-PCR方法 擴增分別得到TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D編碼基因的1284bp全長cDNA ; (b)構建科農(nóng)9204的突變?nèi)后w，利用離子束輻射品種科農(nóng)9204的種子，獲得包含1881 個家系的后代M2群體；每個系隨機選取3個掛牌標記的單株，取其葉片，提取DNA，得突變?nèi)?體的DNA池； (c) 根據(jù)TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D保守序列設計引物，篩選其上游引物核苷酸序 列如SEQ ID N0 : 1所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID N0 : 2所示，用篩選到的所述引 物對小麥科農(nóng)9204的基因組DNA進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物電泳分離，獲得對應的擴增產(chǎn) 物分子量分別為555bp、466bp和426bp ; (d) 應用步驟（c)所述分子標記的上、下引物擴增步驟（b)所述的突變?nèi)后w的基因組 DNA，PCR擴增后，將電泳分離條帶與科農(nóng)9204的擴增條帶進行比較，篩選出其中缺失分 子量為555bp、466bp或426bp中任意一條帶的突變體，即分別得到TaGS2-A、TaGS2-B或 TaGS2-D的單基因缺失突變體植株； (e) 通過將TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D的單基因缺失突變體進行雜交，獲得TaGS2-A/ B、TaGS2-B/D和TaGS2-A/D雙重基因缺失突變體植株； (f) 將步驟（d)和步驟（e)所篩選到的單基因和雙重基因缺失的突變體植株進行田間 種植，采收，統(tǒng)計其株高數(shù)，以科農(nóng)9204為對照，得知單基因缺失的突變體植株其株高較對 照降低，雙重基因缺失的突變體植株較對照顯著降低，即獲得分子標記IN10為與小麥株高 相關基因的分子標記。
[0010] 本發(fā)明提供的分子標記能夠在小麥株尚相關的連j因進彳丁定位或檢測，為選 育目標株高的小麥品種提供指導依據(jù)。
[0011] 本發(fā)明還公開了一種篩選小麥品種或品系植株高矮類型的方法，包括以下步驟： (1) 用分子標記IN10的標記引物對待測小麥品種或品系的DNA分別進行PCR擴增，其 PCR擴增體系為20 yl，包括：2XTaq PCRMasterMix 10yl，上、下游引物各lyl，待測小 麥的DNA模板1 y 1，其余用ddH20補足；PCR擴增程序為：94°C預變性5 min ;94°C變性30 s，56°C退火30 s，72°C延伸1 min/kb，30個循環(huán)；72°C后延伸7 min;20°C保存；得擴增產(chǎn) 物； (2) 將所述擴增產(chǎn)物電泳分離后，如獲得的擴增產(chǎn)物中僅出現(xiàn)分子量為555bp、466bp 和426bp中的任意一條帶，以科農(nóng)9204為對照植株，則該小麥為株高顯著矮于對照植株的 品種或品系；如獲得的擴增產(chǎn)物中同時出現(xiàn)分子量分別為555bp、466bp和426bp中的任意 兩條帶，則該小麥為株高矮于對照植株的品種或品系；如獲得的擴增產(chǎn)物中同時出現(xiàn)分子 量為555bp、466bp和426bp的三條帶，則該小麥為株高與對照植株株高基本一致的品種或 品系。
[0012] 本發(fā)明步驟（2)中所述電泳分離是指在2%瓊脂糖凝膠上穩(wěn)壓100V電泳分離或6% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠上穩(wěn)壓120 V電泳分離；所述2%瓊脂糖凝膠是指100 ml的TAE 緩沖液中含有2 g瓊脂糖粉；所述6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠是指100ml聚丙烯酰胺凝膠 溶液中含有5. 85 g丙烯酰胺和0. 15 g甲叉丙烯酰胺。
[0013] 本發(fā)明所用科農(nóng)9204為審定品種，于2002年通過河北省農(nóng)作物品種審定委員會 審定；2003年通過全國品種審定，品種審定編號為國審麥2003037。
[0014] 本發(fā)明構建了小麥科農(nóng)9204的突變?nèi)后w，通過設計并篩選了分子標記引物成功 篩選到不同基因缺失的突變體，并通過不同基因缺失的突變體的株高性狀表 型鑒定，得到了與小麥株高相關基因的分子標記，該標記可有效篩選待測小麥是否 含有控制小麥株高相關的基因，同時，本發(fā)明還公開了一種利用該分子標記來篩選 小麥植株高矮的方法，采用這種篩選方法可以有目的地選擇雜交親本，為選育不同植株高 矮類型的小麥新品種做科學的指導，從而可以加快塑造合理的小麥株高發(fā)生群體，這對提 高小麥群體質量和產(chǎn)量具有很大的貢獻作用。
[0015] 本發(fā)明提供了與小麥株高相關的分子標記應用于小麥育種中，不僅篩選快速精 準，不受環(huán)境影響，選擇目標明確，而且節(jié)約了生產(chǎn)成本，大大提高了高產(chǎn)小麥品種或品系 的選擇效率和質量。
【附圖說明】
[0016] 圖1為在科農(nóng)9204中克隆的位于不同染色體上的基因的編碼核苷酸序列。
[0017] 圖2為用于鑒定7^61^-兒7^61^-所P 基因缺失突變體的擴增產(chǎn)物的核苷 酸序列。
[0018] 圖3為7^5U、7^52-所卩7^52-々的單基因缺失突變體，以及通過兩兩雜交獲 得TaGS2-A/B、TaGS2-B/D和TaGS2-A/D雙重基因缺失突變體電泳圖譜。
[0019] 圖4為7^5U、7^52-所卩7^52-々的單基因缺失突變體，以及通過兩兩雜交獲 得TaGS2-A/B、TaGS2-B/D和TaGS2-A/D雙重基因缺失突變體植株中GS酶活性測定圖。
[0020] 圖5為7^61^-兒7^61^-所P 7^61^-々的單基因缺失突變體，以及通過兩兩雜交獲 得TaGS2-A/B、TaGS2-B/D和TaGS2-A/D雙重基因缺失突變體植物株高的表型圖。
[0021] 圖6為7^61^-兒7^61^-所P 7^61^-々的單基因缺失突變體，以及通過兩兩雜交獲 得TaGS2-A/B、TaGS2-B/D和TaGS2-A/D雙重基因缺失突變體植物株高的表型統(tǒng)計圖。
【具體實施方式】
[0022] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例中所用的試驗材料、試劑等，如無特殊說明，均 可從商業(yè)途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0023] 實施例1與小麥株高相關的基因的分子標記的獲得 1、小麥科農(nóng)9204的基因的克隆 根據(jù)數(shù)據(jù)庫分析的結果設計引物： 上游引物核苷酸序列：5'-1〇：1^〇：1^61'(：111^〇1^61'-3'（5￡0 10勵：3) 下游引物核苷酸序列：5'-AGTGCCCCGACGGAACCACAGG