-3'（SEQ ID N0 : 4) 提取六倍體小麥科農(nóng)9204三葉期幼苗總RNA，采用RT-PCR方法擴增得到TaGS2-A、 TaGS2-B 和 TaGS2-D 編碼基因的 1284bp 全長 cDNA。
[0024] 具體操作過程如下： 1)植物總RNA提?。阂旱心?00 mg小麥科農(nóng)9204的幼苗，研碎后轉移到含1 mL Trizol試劑的EP管中，充分混勻，室溫靜置5 min ;加入0. 2 mL氯仿，充分混勻，室溫靜置 2-3 111；[11;1200(^，4°0，離心15 111；[11;把上層無色的水相轉移到一個新的1.5 111]^￡?管中，加 入0.5 11^異丙醇，混勻后室溫放置10 1^11;1200(^，41：，離心10 1^11;去上清，將8隱沉淀 用1 mL 75%乙醇清洗，7500g，4°C，離心5min，之后風干；將沉淀溶于適量RNase-free的去 離子水中，60°C促溶10 min;微量分光光度計（NanoDrop ND-2000 Spectrotometer)定量， 電泳分析RNA完整性； 2) RT-PCR :按照 RNA PCR Kit(AMV) Ver. 3. 0 (TaKaRa, DRR019A)試劑盒的說明書進 行。首先進行第一步反轉錄反應，以500 ng RNA為模板進行反轉錄，在反應體系中依次加 入MgCl2 2 y 1、10 X反轉錄緩沖液1 y 1、無RNA酶水3. 75 y 1、dNTP 1 y 1、RNA酶抑制劑 0.25yl、AMV 反轉錄酶 0.5yl、01igo Dt 0.5yl、總 RNA lyl，反應體系共 10 yL。反 應程序為：42°C 30 min，99°C 5 min，5°C 5 min，得到含有第一鏈cDNA的混合物；從樣品 中取出等量的cDNA(l yL)作為第二步PCR的模板，進行PCR擴增，PCR反應體系：10 yL 2XTaq PCR MasterMix，lyL上游引物，lyL下游引物，1 yL模板，ddH20補足終體積為 20 yL。PCR 反應程序：94°C預變性 5 min;94°C變性 30 sec，58°C延伸 30 sec，72°C退火 1 min/kb，30個循環(huán)；72°C延伸7 min ; 20°C保存；通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，產(chǎn) 物條帶大小約為1284bp。
[0025] 將得到目的條帶切膠回收后連入pEASY-Blunt cloning vector ;對兩次獨立的反 轉錄和PCR及連接所得到的19個克隆進行測序，根據(jù)與中國春（CS)和小偃54 (XY54)中已 知的TaGS2 A組、B組和D組序列進行比對，得到了科農(nóng)9204中TaGS2 A組、B組和D組序 列，0RF均為1284 bp，其序列見圖1，分別命名為7^652-兒7^652-所卩7^仍之-從
[0026] 2、構建小麥科農(nóng)9204的突變群體及突變群體的DNA池 1)實驗材料為小麥品種科農(nóng)9204 (Kn9204)?？妻r(nóng)9204是由冀麥38作母本，SA502 (八倍體小偃麥X普通小麥雜交后代)作父本雜交選育而成，2003年通過國家品種審定。該 品種是一個綜合農(nóng)藝性狀好、高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)性突出、適應性廣的小麥品種，生產(chǎn)上已大面積推 廣應用。選取均勻一致的科農(nóng)9204種子，利用氮離子能量30kev，劑量8X10 17離子/ cm2， 輻射小麥品種科農(nóng)9204的種子，獲得包含1881個家系的后代M2群體； 誘變材料在中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研宄所農(nóng)業(yè)資源研宄中心欒城農(nóng)業(yè)實驗站 (N 37° 53'，E 114° 41'，海拔50. 1 m)田間種植。設計行長4m，行距25cm，株距10cm，正 常供氮區(qū)域種植。以野生型科農(nóng)9204作為對照，以每20行/系一行/系對照組的頻率種 植。試驗區(qū)四周設保護行，田間統(tǒng)一管理。
[0027] 2) M2代誘變群體返青后，選取1881個系，每個系隨機選取3個掛牌標記的單株， 取其約2cm長度的葉片；用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京）提 取DNA。超微量紫外可見分光光度法（Nanodrop 2000C)檢測樣品濃度與純度，-70 °C冰箱保 存。
[0028] 3、篩選小麥TaGS2基因缺失突變體的分子標記 基因組DNA的PCR擴增：根據(jù)、7^公-所卩7^公-糾呆守序列設計引物，用篩選 到的標記引物： 上游引物核苷酸序列：5' - TGGCTGCCACACAAATTACAG -3'（如 SEQ ID N0: 1)， 下游引物核苷酸序列：5' - CCTTCTTGATCACGTCGAAAC -3'（如 SEQ ID NO: 2); 擴增科農(nóng)9204基因組DNA，其PCR反應體系：10yL 2XTaq PCR MasterMix，lyL上游 引物，luL下游引物，lyL科農(nóng)9204小麥基因組DNA模板，加ddH20至終體積為20 y L，PCR 反應程序：94°C預變性5 min;94°C變性30 s，56°C退火30 s，72°C延伸1 min/kb，30個循 環(huán)；72 °C延伸7 min ; 20 °C保存；通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，同時擴增出三個不 同大小分別為466bp、426bp和555bp的屬于A、B和D組的片段產(chǎn)物條帶，即作為篩選小麥 TaGS2基因缺失突變體的分子標記；其引物擴增序列差異比較見圖2。
[0029] 4、7^61^-所卩單基因缺失突變體的篩選及鑒定 由于離子束誘變會造成了 h仍習的基因組DNA缺失，那么相較于野生型科農(nóng)9204可以 同時擴增出三條帶，而發(fā)生缺失變異的突變體只能擴增出兩條或更少的條帶，所以本發(fā)明 采用標記引物對化61^-兒7^61^-所卩7^61^-^單基因缺失突變體進行篩選。具體采用步驟 (3)所述設計的標記記引物對科農(nóng)9204離子束誘變群體仏代5643個單株進行擴增，擴增 體系及擴增層序同本實施例步驟1，PCR擴增后，將其條帶與野生型Kn9204的擴增條帶進行 比較，篩選到分屬于2、8和2個不同家系的突變體，得到7^5U、7^52-所卩7^52-加勺單 基因缺失突變體，分別命名為gs2-a，gs2-b和gs2-d，序列差異比較見圖2 ;并對篩選的突變 體進行了三次重復取材驗證，其突變體篩選電泳鑒定結果如圖3。
[0030] 5、從僻P 雙重基因缺失突變體植物的獲得及鑒定 通過將7^5U、7^52-所P 單基因缺失突變體進行雜交，獲得7^5U/從 僻卩雙重基因缺失突變體植株，分別命名為gs2-a gs2-b，gs2-b gs2-d 和 gs2_a gs2_d。
[0031] 對雙重突變體gs2_a gs2_b，gs2_b gs2_d和gs2_a gs2_d進行如步驟1的PCR體 系及程序進行擴增，其擴增電泳分離結果見圖3。
[0032] 突變體的酶活性分析過程：選長勢一致的植株，取第二片展開葉作為材料，用谷氨 酰胺合成酶試劑盒(建成科技有限公司，南京）進行GS酶活性測定。谷氨酰胺和羥胺在谷 氨酰胺合成酶的作用下可以生產(chǎn)Y _谷氨酰氧肟酸，通過顯色反應可測定谷氨酰氧肟酸 的含量。實驗三次重復，取平均值。結果顯示，gs2_a、gs2_b和gs2_d以及gs2_a gs2_b， gs2-b gs2-d和gs2-a gs2-d的谷氨酰胺合成酶活性均低于野生型Kn9204,見圖4,其中雙 重突變體gs2_a gs2_b，gs2_b gs2_d和gs2_a gs2_d的酶活性較單突變體gs2_a、gs2_b和 gs2-d更低，表明TaGS2基因的缺失突變對GS的酶活性有很大影響。
[0033] 所取每株系20個單株測定GS活性，從圖4中株系間平均結果顯示，單基因缺失突 變體酶活略有下降，而雙重突變體較野生型下降51. 6-59. 2%。
[0034] 6、7^5U、7^52-所P 單基因和雙重基因缺失突變體的表型觀察 將篩選獲得的突變體材料在中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研宄所農(nóng)業(yè)資源研 宄中心欒城農(nóng)業(yè)實驗站（N 37° 53'，E 114° 41'，海拔50. lm)田間種植；設計行長4m，行 距25cm，株距10cm，正常供氮區(qū)域種植；以野生型科農(nóng)9204作為對照，設三組實驗重復；試 驗區(qū)四周設保護行，田間統(tǒng)一管理；實驗重復兩年，6月15-20日成熟期收獲，調查表型，結 果取平均值。
[0035] 對植株株高進行觀察結果見圖6。如圖6所示，與野生型（WT)科農(nóng)9204相比， 7^652-所卩 基因缺失突變體 gs2-a、gs2-b 和 gs2-d 株高較低，7^652-4/從 僻P 雙重基因缺失突變體gs2-a gs2-b、gs2-b gs2-d和gs2-a gs2-d 株高最低。
[0036] 野生型及單/雙突變體每系20株收獲后考種，結果如圖6所示：單基因突 變體的株高降低，其雙基因突變體的植株株高降低減少21. 2-14. 4%。
[0037] 由此可以得到分子標記IN10為與小麥株高相關TaGS2基因的分子標記。
[0038] 實施例2分子標記IN10在檢測篩選小麥品種或品系株尚中的應用 (1) 用IN10的標記引物(上游引物核苷酸序列如SEQ ID N0:1、下游引物核苷酸序列如 SEQ ID N0:2)對小麥品種科農(nóng)9204為親本的F6R RIL群體的188個衍生品系的DNA分 別進行？〇?擴增，其？0?擴增體系為20^1，包括：2\了&9?0?1&18七61]^110^1，上、下游 引物各1 u 1，待測小麥的DNA模板1 y 1，其余用ddH20補足；PCR擴增程序為：94°C預變性 5 min;94°C 變性 30 s，56°C 退火 30 s，72°C 延伸 1 min/kb，30 個循環(huán)；72°C 后延伸 7 min; 20°C保存； (2) 將上