板栗種仁α-1,6-葡聚糖及其制備方法以及在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物多糖及其制備方法與應(yīng)用，尤其是涉及一種板栗種仁 a -1,6-葡聚糖及其制備方法以及在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 板栗為殼斗科栗屬植物的果實(shí)，味甘，性溫，無毒，有益氣補(bǔ)脾、厚腸胃、補(bǔ)腎強(qiáng)筋、 活血止血、清熱解毒、止瀉治咳等功效。臨床上，板栗還可用于治療反胃、泄瀉、腰腿軟弱、吐 血、便血、金瘡等癥。多糖作為板栗種仁的重要組成物質(zhì)，因其生物功能廣泛、毒副作用小等 諸多優(yōu)勢，受到各國研發(fā)人員的極大重視。
[0003] 從鎮(zhèn)安板栗中分離得到多糖組分CPS-a和CPS-b，具有抗氧化和抗疲勞作用（板 栗多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)分析及體外抗氧化研宄，陜西師范大學(xué)，碩士論文，2011 ;板栗多糖 的分離純化、結(jié)構(gòu)分析及抗疲勞作用的研宄，食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013, 32, 767-772)。羅 田板栗中的多糖由葡萄糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖組成，比例為〇. 58 :1. 00 :0. 33 :0. 18， 平均分子量為164. OkDa，具有抗氧化、抗腫瘤、抗凝血和升高白細(xì)胞等活性，濃度為Img/ mL時，對人肝癌細(xì)胞H印G2和宮頸癌細(xì)胞HeLa的抑制率分別為32. 8%和12. 1% (羅田 板栗多糖的分離純化及成分分析，中國藥學(xué)雜志，37 (1)，63-64, 2002 ;板栗多糖的提取、成 分分析及活性測定，武漢理工大學(xué)學(xué)報(bào)，32(11)，14-16,2010 ;板栗多糖的分離純化、結(jié)構(gòu) 鑒定及其活性研宄，江蘇大學(xué)，碩士論文，2013)。燕龍板栗多糖對人肝癌細(xì)胞Bel-7402、 肺癌細(xì)胞A-549和子宮癌細(xì)胞HCT-8的抑制作用較明顯，多糖濃度為0. 3mg/mL時，抑制 率分別為69. 5%、51.4%和55.3% (板栗不同品種（系）多糖結(jié)構(gòu)和活性的初步研宄， 河北科技師范學(xué)院，碩士論文，2013)。Barbat等從歐洲板栗堿提取物中，分離得到木聚 糖，結(jié)構(gòu)為4-0-甲基葡萄糖醛酸木聚糖和同木聚糖，其中4-0-甲基葡萄糖醛酸木聚糖 可抑制人表皮癌細(xì)胞A431的增生、迀移和侵襲的能力（Structural Characterization and Cytotoxic Properties of a 4-〇-MethylglucuronoxyIan from Castanea sativa. 2. evidence of a structure-activity relationship,Journal of Natural Product，71，1404 - 1409, 2008) 〇
[0004] 以上研宄中提取得到的多糖均由多種單糖組成，為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜聚多糖，其僅顯 示出在抗氧化、抗疲勞和抗腫瘤活性上面的性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是提供一種板栗種仁α -1，6-葡聚糖。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供一種以迀西板栗種仁為原料制備板栗種仁α -1，6-葡 聚糖的方法。
[0007] 本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供板栗種仁α -1，6-葡聚糖在制備抗腫瘤藥物上的 應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的是提供一種以板栗種仁α -1，6-葡聚糖為有效成分的 藥物組合物。
[0009] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[00?0] -種板栗種仁α -1，6_匍聚糖，其結(jié)構(gòu)式為[(1 - 6) - a -Glcp (1 - ]η，其中η為 正整數(shù)，其重均分子量范圍為1600~2400kDa，平均分子量為2000kDa。
[0011] -種以迀西板栗種仁為原料制備所述板栗種仁α -1，6-葡聚糖的方法，包括以下 步驟：
[0012] a.多糖提?。恨|西板栗種仁干燥、粉碎，乙醇脫脂，水提，離心，上清液減壓濃縮， 醇沉，冷凍干燥，得板栗水提粗多糖；
[0013] b.多糖純化：上述板栗水提粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白，離心，上清液先用截留分 子量為3500的透析袋透析，再依次采用陰離子交換色譜柱和凝膠滲透色譜柱分離純化，得 α-1，6_葡聚糖。
[0014] 優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：
[0015] a.多糖提?。簩⑥|西板栗種仁干燥、粉碎，用95%乙醇脫脂，室溫干燥，得板栗種 仁粉末；取板栗種仁粉末，加水，二者的質(zhì)量體積比為Ig : 10~30ml，室溫靜置2~4h后， 冷水提取，提取液離心后沉淀重復(fù)提取2~4次，所得上清液合并后減壓濃縮，加入2~5 倍體積的95%乙醇，4°C靜置過夜，抽濾，所得沉淀冷凍干燥，得板栗水提粗多糖；
[0016] b.多糖純化：板栗水提粗多糖配制成水溶液，加入等體積的氯仿/正丁醇混合液， 室溫劇烈攪拌1~3h，靜置分液，上層水相重復(fù)上述操作1~3次，合并上層水相并濃縮，濃 縮后的上層水相用截留分子量為3500的透析袋對蒸餾水透析3~5d，對透析袋內(nèi)的液體濃 縮，采用Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱進(jìn)行分離，以水進(jìn)行洗脫，收集水洗脫 組分，濃縮后，溶于0. 2mol/L的碳酸氫銨溶液中，離心后經(jīng)S印hacryl S-300凝膠滲透色譜 柱分離純化，得α-1，6-葡聚糖。
[0017] 優(yōu)選地，所述步驟a中板栗種仁粉末與水的質(zhì)量體積比為Ig :20ml。
[0018] 優(yōu)選地，所述步驟a的醇沉操作中95%乙醇的加入量為濃縮后上清液體積的3倍。
[0019] 另一方面，本發(fā)明提供所述板栗種仁α -1，6-葡聚糖在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng) 用，具體地說，所述腫瘤為宮頸癌、乳腺癌或耐藥乳腺癌，尤其是耐阿霉素乳腺癌。
[0020] 再一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含本發(fā)明所述的板栗種仁α -1，6-葡聚 糖作為有效成份，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。
[0021] 本發(fā)明提供的藥物組合物，含有板栗種仁α-l，6-葡聚糖、制藥學(xué)上許可的載體 或以板栗種仁α -1，6-葡聚糖作為活性成分的混以藥用賦形劑或稀釋劑的組合。
[0022] 所述的藥物組合物的制藥學(xué)上許可的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如： 稀釋劑如水等，賦形劑如淀粉、蔗糖等，粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠等，潤濕劑如 甘油等，崩解劑如瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣等，吸收劑如季銨化合物等，表面活性劑如十六烷 醇等，吸附載體如高嶺土等，潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。另外還可以在組合物 中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
[0023] 本發(fā)明提供的藥物組合物可以通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用 于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊 等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其他液體制劑如糖漿、酊劑等；用于腸胃外給藥時，可 將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等，優(yōu)選的形式是片劑、膠囊和注射劑。
[0024] 本發(fā)明提供的藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備，例 如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。
[0025] 本發(fā)明提供的板栗種仁α -1，6-葡聚糖為均聚多糖，通過本發(fā)明提供的制備方法 制得的板栗種仁α -1，6-葡聚糖，糖鏈的結(jié)構(gòu)完整性好。其除體外對宮頸癌細(xì)胞HeLaU7I 癌細(xì)胞MCF-7具有顯著的抑制活性，還對耐阿霉素乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR的增殖具有更優(yōu) 良的抑制活性。
【附圖說明】
[0026] 圖1是α -1，6-葡聚糖的純度鑒定圖。
[0027] 圖 2 是 α -1，6-葡聚糖的 13C NMR(DEPT)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法， 所用試劑未標(biāo)明來源、規(guī)格的均為市售分析純或化學(xué)純。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 將迀西板栗種仁（產(chǎn)地為河北省迀西縣）干燥、粉碎，所得粉末用95%乙醇脫脂2 天，室溫干燥后，取100g的板栗種仁粉末加入2000mL的水，室溫靜置2h后，冷水?dāng)嚢杼崛?2h，離心，殘?jiān)韵嗤瑮l件再重復(fù)提取2次，合并上清液，減壓濃縮至150mL，在攪拌下加入3 倍體積的95%乙醇，4°C靜置過夜，抽濾，無水乙醇脫水，所得沉淀冷凍干燥，得板栗水提粗 多糖9. 6g。
[0031] 取板栗水提粗多糖Ig配制成1 %的水溶液（W/V，質(zhì)量體積濃度），采用Sevag 法脫蛋白，加入等體積的氯仿/正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=4:1 ;V/V，體積比），室溫 劇烈攪拌2h，靜置分液，上層水相重復(fù)脫蛋白步驟2次，合并上層水相并濃縮。濃縮后的 上層水相用截留分子量為3500的透析袋對蒸餾水透析3d，對透析袋內(nèi)的液體濃縮，采用 Q-Se