pharose Fast Flow陰離子交換色譜柱對(duì)多糖進(jìn)行分離，以去離子水洗脫，硫酸-苯酷 檢測(cè)，收集去離子水洗脫多糖組分，濃縮冷凍干燥后得多糖CPO。將多糖CPO溶于0. 2mol/L 碳酸氫按溶液，離心后經(jīng)Sephacryl S-300凝膠色譜柱分離，流速為0. 35mL/min，硫酸苯酷 法檢測(cè)，收集多糖組分，得多糖CP 0. 45g。
[0032] 多糖結(jié)構(gòu)解析：
[0033] 采用高效凝膠色譜法（HPGPC)測(cè)定產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量和純度，純度鑒定結(jié)果如 圖1所示，為單一對(duì)稱洗脫峰，說(shuō)明所得多糖為結(jié)構(gòu)均一的多糖，產(chǎn)物的相對(duì)重均分子量為 2000kDa。所用儀器為Agilent 1260高效液相色譜儀，流動(dòng)相為0. lmol/L硫酸鈉，色譜柱 為 Shodex Ohpak SB-804,流速為 0.5ml/min，柱溫為 35°C。
[0034] 單糖組成分析表明多糖CP由葡萄糖組成。
[0035] 經(jīng)旋光儀測(cè)定產(chǎn)物的比旋光度為[a ]2°D= +203° (c 1.0 H 20)，其中測(cè)試條件為： 溫度20°C，濃度為0. lg/100mL，水為溶劑。
[0036] 甲基化分析多糖CP的連接方式，結(jié)果表明多糖CP為1，6-連接的葡萄糖。
[0037] 圖2所示為多糖CP的13C NMR(DEPT)譜圖，圖中位于δ 98. 5ppm的碳信號(hào)為α-葡 聚糖的 C-I 信號(hào)，其他碳信號(hào)依次為 C-2 ( δ 72. 2ppm)，C-3 ( δ 74. 2ppm)，C-4 ( δ 70. 3ppm)， C_5 ( δ 71. Oppm)和 C_6 ( δ 66. 4ppm)。
[0038] 以上結(jié)果表明多糖CP的結(jié)構(gòu)為：
[0039] [― 6)-a-Glcp(l - ]n
[0040] 其中η為正整數(shù)。
[0041] 實(shí)施例2
[0042] 抑制癌細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
[0043] 1.試驗(yàn)材料
[0044] 受試樣品：實(shí)施例1中制備的α -1，6-葡聚糖。
[0045] 陰性對(duì)照品：生理鹽水。
[0046] 空白對(duì)照品：PBS。
[0047] 細(xì)胞株：人宮頸癌細(xì)胞HeLa、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、耐阿霉素乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ ADR(均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）。
[0048] 試劑和儀器：0· 25%胰蛋白酶（Invitrogen 公司）、MTT(5mg/mL, Sigma 公司）；酶 標(biāo)儀（Bio-Rad 3550,美國(guó)）。
[0049] 2.試驗(yàn)方法
[0050] 2. 1藥物處理計(jì)量及配制方法
[0051] 將實(shí)施例1中制備的α -1，6-葡聚糖溶于PBS中，配制成濃度分別為250 μ g/mL， 500 μ g/mL，1000 μ g/mL，2000 μ g/mL，4000 μ g/mL 的系列溶液。
[0052] 2· 2細(xì)胞培養(yǎng)
[0053] 人宮頸癌細(xì)胞HeLa用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于5% CO2培養(yǎng)箱37°C培 養(yǎng)，2-3天換液1次。細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，用0. 25%胰蛋白酶消化后，以2X IO4個(gè)/mL細(xì)胞接 種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔體積90 μ L，37°C培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。
[0054] 乳腺癌細(xì)胞|〇^-7和耐阿霉素乳腺癌細(xì)胞1^-7/^1?分別用含10%胎牛血清的 1640培養(yǎng)基于5% CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)，2-3天換液1次。細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，用0. 25%胰蛋 白酶消化后，以2 X IO4個(gè)/mL細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔體積90 μ L，37°C培養(yǎng)使細(xì) 胞貼壁。
[0055] 2. 3 α -1，6-葡聚糖對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用
[0056] 向細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入系列濃度（250 μ g/mL，500 μ g/mL，1000 μ g/mL， 2000 μ g/mL，4000 μ g/mL)的α -1，6-葡聚糖溶液10 μ L使其終濃度分別為25 μ g/mL， 50 μ g/mL，100 μ g/mL，200 μ g/mL，400 μ g/mL，空白對(duì)照組為等體積的PBS，陰性對(duì)照為等體 積的生理鹽水。加樣組和對(duì)照組均設(shè)3個(gè)復(fù)板，板上均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞在溫度37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中，加樣組和對(duì)照組的復(fù)板分別在孵育24h、48h和72h之后測(cè)定OD值，以計(jì) 算不同濃度的受試樣品在不同時(shí)間對(duì)三種癌細(xì)胞的抑制率。測(cè)定方法為：加入MTT，10 μ L/ 孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入DMSO 100 μ L/孔，放置過(guò)夜后，分別用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定 各孔的OD值。
[0057] 數(shù)據(jù)處理：細(xì)胞存活率（％ ) = [0D加藥組_0D空白]/[ODp月性對(duì)照組_0D空白];
[0058] 細(xì)胞抑制率（％ ) = 100% -細(xì)胞存活率（％ );
[0059] 試驗(yàn)結(jié)果如表1、表2所不。
[0060] 表1 α -1，6-葡聚糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖抑制率
[0061]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種板栗種仁a -1，6-葡聚糖，其結(jié)構(gòu)式為： [(1 - 6)-a-GlcMl -]n， 其中n為正整數(shù)，其重均分子量范圍為1600~2400 kDa，平均分子量為2000 kDa。
2. -種以迀西板栗種仁為原料制備如權(quán)利要求1所述的板栗種仁a -1，6-葡聚糖的方 法，其特征在于，包括以下步驟： a. 多糖提取：迀西板栗種仁干燥、粉碎，乙醇脫脂，水提，離心，上清液減壓濃縮，醇沉， 冷凍干燥，得板栗水提粗多糖； b. 多糖純化：上述板栗水提粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白，離心，上清液先用截留分子 量為3500的透析袋透析，再依次采用陰離子交換色譜柱和凝膠滲透色譜柱分離純化，得 a-1，6-葡聚糖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： a. 多糖提?。簩⑥|西板栗種仁干燥、粉碎，用95%乙醇脫脂，室溫干燥，得板栗種仁粉 末；取板栗種仁粉末，加水，二者的質(zhì)量體積比為Ig : l〇~30ml，室溫靜置2~4h后，冷水提取， 提取液離心后沉淀重復(fù)提取2~4次，所得上清液合并后減壓濃縮，加入2~5倍體積的95%乙 醇，4°C靜置過(guò)夜，抽濾，所得沉淀冷凍干燥，得板栗水提粗多糖； b. 多糖純化：板栗水提粗多糖配制成水溶液，加入等體積的氯仿/正丁醇混合液，室 溫劇烈攪拌l~3h，靜置分液，上層水相重復(fù)上述操作1~3次，合并上層水相并濃縮，用截留 分子量為3500的透析袋對(duì)蒸餾水透析3~5 d，對(duì)透析袋內(nèi)的液體濃縮，采用Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱進(jìn)行分離，以水進(jìn)行洗脫，收集水洗脫組分，濃縮后，溶于 0. 2 mol/L的碳酸氫銨溶液中，離心后經(jīng)S印hacryl S-300凝膠滲透色譜柱分離純化，得 a-1，6-葡聚糖。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟a中板栗種仁粉末與水的質(zhì) 量體積比為Ig :20ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟a的醇沉操作中95%乙醇的 加入量為濃縮后上清液體積的3倍。
6. 權(quán)利要求1所述的板栗種仁a -1，6-葡聚糖在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為宮頸癌、乳腺癌或耐藥乳腺 癌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤耐阿霉素乳腺癌。
9. 藥物組合物，其特征在于，其中含權(quán)利要求1所述的板栗種仁a -1，6-葡聚糖作為有 效成份，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種板栗種仁α-1,6-葡聚糖及其制備方法以及在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述板栗種仁α-1,6-葡聚糖的結(jié)構(gòu)式為[→6)-α-Glcp(1→]n，其重均分子量范圍為1600~2400kDa，平均分子量為2000kDa，為均聚多糖，其體外對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和耐阿霉素乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR的增殖具有顯著的抑制活性，且板栗作為藥食兩用的果中珍品，無(wú)嚴(yán)重的毒副作用；通過(guò)本發(fā)明提供的制備方法制得的板栗種仁α-1,6-葡聚糖，糖鏈的結(jié)構(gòu)完整性好，有望開(kāi)發(fā)為抗腫瘤藥物或抗腫瘤輔助藥物。
【IPC分類】A61P35-00, A61K31-716, C08B37-02, A61K36-185
【公開(kāi)號(hào)】CN104861085
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510333089
【發(fā)明人】李紅燕, 王應(yīng)杏, 張金超, 王書(shū)香, 李勝輝, 周?chē)?guó)強(qiáng), 劉丹丹
【申請(qǐng)人】河北大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月26日
【申請(qǐng)日】2015年6月16日