簇毛麥6vs染色體特異性分子標(biāo)記6vs-bh1及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種一種簇毛麥6VS染色體特異性分子標(biāo)記6VS-BH1及其用途，屬于 分子生物學(xué)和遺傳育種科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥白粉病是由小麥白粉菌（財(cái)應(yīng)eria 5/7. iriiici)引起的真菌 性病害，是影響小麥生產(chǎn)的主要病害之一。培育抗病品種是規(guī)避小麥白粉病危害的最經(jīng) 濟(jì)、有效的途徑，其關(guān)鍵是抗白粉病基因的發(fā)掘與利用。作為小麥抗白粉病育種的重要野 生資源，簇毛麥應(yīng)VV，2/?=辦=14)對(duì)已知小麥白粉菌生理小種表 現(xiàn)完全免疫或高抗，其抗病基因已被多個(gè)課題組成功轉(zhuǎn)移到普通小麥背景。例如，陳佩度 課題組將來(lái)自英國(guó)劍橋植物園的簇毛麥6VS染色體攜帶的基因轉(zhuǎn)移到小麥中，育成 小麥-簇毛麥T6VS. 6AL易位系，該易位系中的6VS能穩(wěn)定遺傳且對(duì)農(nóng)藝的不利影響少，因 而作為抗性親本被廣泛應(yīng)用于小麥抗白粉病育種，迄今已育成20多個(gè)品種，推廣面積超過(guò) 5000 萬(wàn)畝（Cao A, Xing L，Wang X，Yang X，Wang W，Sun Y，Qian C，Ni J，Chen Y， Liu D and Chen P. Serine/threonine kinase gene Stpk-V, a key member of powdery mildew resistance gene Pm21, confers powdery mildew resistance in wheat. Proc Natl Acad Sci USA. 2011, 108: 7727-7732·)。前蘇聯(lián)簇毛麥種質(zhì) No. 1026 的 6VS 染 色體上攜帶的/?堪因?qū)氲叫←溨?，?chuàng)制了 T6VS. 6DL易位系（Pm97033等，Li H, Chen X, Xin ZY, Ma YZ, Xu HJ, Chen, XY and Jia X. Development and identification of wheat-Haynaldia villosa T6DL. 6VS chromosome translocation lines conferring resistance to powdery mildew. Plant Breeding. 2005, 124: 203-205·)，目前也已進(jìn) 一步育成揚(yáng)麥22等抗白粉病品種。
[0003] 易位系T6VS. 6AL (/?泛7基因）和易位系T6VS. 6DL ( /?堪因）都具有廣譜高效 的白粉病抗性，在生產(chǎn)上具有重要的應(yīng)用價(jià)值，而開(kāi)發(fā)6VS染色體特異性分子標(biāo)記對(duì)于 提高小麥抗白粉病育種效率具有重要意義。目前已公布了一些與6VS上抗白粉病基因 連鎖的相關(guān)分子標(biāo)記 0PT17 14QQ、0PT17腳、SCAR14QQ、SCAR1265、NAU/XiBaol6 1586和 NAU/ XiBaol5902 (Cao, A. Z. , X. E. Wang, Y. P. Chen, X. ff. Zou, and P. D. Chen, 2006: A sequence-specific PCR marker linked with Pm21 distinguishes chromosomes 6AS, 6BS, 6DS of Triticum aestivum and 6VS of Haynaldia villosa. Plant Breeding 125, 201-205.)。但是，總體而言，這些標(biāo)記在標(biāo)記輔助選擇育種中大多存在不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，一個(gè) 原因是由標(biāo)記類型決定的，如RAH)標(biāo)記0PT17 14(?和0PT17 其次是由于PCR反應(yīng)體系和 反應(yīng)條件要求苛刻，PCR結(jié)果可重復(fù)性差造成的。這些缺點(diǎn)均不利于標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在 小麥育種實(shí)踐中的應(yīng)用。此外，絕大多數(shù)分子標(biāo)記不能在小麥背景中同時(shí)區(qū)分基因和 /?堪因，難以在這兩個(gè)基因的聚合育種中應(yīng)用。
[0004] 前人在開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記時(shí)，大多借助已經(jīng)定位于基因組物理圖上的EST (expressed sequence tag,表達(dá)序列標(biāo)簽)序列設(shè)計(jì)引物（陳升位，陳佩度.簇毛麥6VS染色體短臂特 異性EST標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及缺失定位.麥類作物學(xué)報(bào).2010，30(5):798-795.)。但定位在目 標(biāo)染色體區(qū)域的EST數(shù)量有限，能開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記也有限。
[0005] 簇毛麥泣因是位點(diǎn)的關(guān)鍵成員之一，在基因介導(dǎo)的抗白粉病 過(guò)程中發(fā)揮中重要作用。本發(fā)明借助麥類作物-二穗短柄草比較基因組學(xué)，利用二穗短柄 草洞源基因附近的序列搜索小麥基因組中的同源序列，開(kāi)發(fā)分子6VS特異性分子標(biāo) 記，用于快速檢測(cè)和追蹤普通小麥遺傳背景中不同來(lái)源的6VS易位染色體及其控制的抗白 粉病性狀，為小麥抗白粉病分子標(biāo)記輔助選擇育種提供新型、實(shí)用、高效的分子標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種特異追蹤簇毛麥6VS染色體的分子標(biāo)記及其用法。
[0007] 本發(fā)明利用比較基因組學(xué)原理，圍繞簇毛麥抗白粉病基因 (GeneBank登 錄號(hào)：ΗΜ241655)在二穗短柄草中的同源基因開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，即利用物理位置與二穗短柄草 時(shí)目近的序列搜索小麥基因組中的同源序列，設(shè)計(jì)特異性引物，篩選簇毛麥6VS染色 體特異性分子標(biāo)記，為抗白粉病小麥-簇毛麥T6VS. 6AL易位系在小麥抗白粉病新品種培育 中的應(yīng)用提供一種新型、實(shí)用、高效的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)。
[0008] 本發(fā)明篩選到的6VS染色體特異性分子標(biāo)記6VS-BH1的引物如下： 6VS-BH1F :5' - GCCATTATAGTCAAGAGTGCACTAGCTGT -3'（SEQ ID NO. 1)， 6VS-BH1R:5' - AGCTCCTCTCGTTCTCCAATGCT -3' （SEQ ID N0.2)。
[0009] 該分子標(biāo)記用于追蹤小麥6AS、6DS染色體；還用于在小麥背景中區(qū)分小麥-簇毛 麥易位系T6VS. 6AL (/?泛7基因）和易位系T6VS. 6DL ( /?堪因）中的6VS染色體；并且可 用于區(qū)分兩個(gè)易位系是純合體、還是雜合體。
[0010] 本發(fā)明還提供該分子標(biāo)記的具體用法，如下： (1) PCR 反應(yīng)體系：1〇μL 反應(yīng)體系中含約 10-20ng 模板 DNA，1XPCR buffer，l. 5mmol Γ1MgCl2,200mmolΓ1dNTP，兩條引物終濃度各為0.2μmolIΛ0.5U7? ?7DNA聚合酶，用無(wú) 菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至IOML ; (2) PCR反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性20秒，60°C _66°C退火30秒，72°C延 伸60秒，32個(gè)循環(huán)；72°C延伸5分鐘；4°C保存； (3) PCR產(chǎn)物檢測(cè)：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，用銀染法染 色。
[0011] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明公布的分子標(biāo)記6VS-BH1，具有退火溫度寬泛（60°C -66