一種姜黃素衍生物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種姜黃素衍生物的制備方法。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 姜黃素的化學結(jié)構(gòu)式為：
[0003]
[0004] 姜黃素（curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃、莪術(shù)、郁金等的根莖中提取的一 種天然有效成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗HIV、抗高血壓、抗膽固醇、抗凝血等生物活 性，且其分子量小、毒性低，具有良好的臨床應(yīng)用潛力。但因姜黃素在機體內(nèi)藥效不持久、 選擇性低、被機體吸收的能力差、易被降解、生物利用度低等缺點，制約了其在保健食品 和醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。因此，在保留姜黃素原有藥效基礎(chǔ)上，通過化學或生物法制備性 能更好的姜黃素衍生物成為近年來研宄的熱點。Zhang Xing等采用在華根霉（Rhizopus chinensis) IFFI03043培養(yǎng)液中直接加入底物姜黃素的生長培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法制得兩種主要的姜 黃素衍生物一4' -0- β -D-葡萄糖苷姜黃素（產(chǎn)率為57 % )和六氫姜黃素（產(chǎn)率為6. 2 % ) (Biocatalysis and Biotransformation, 2010, 28(5-6):380-386)〇
[0005] 申請人在先專利申請201110025986. 4 (公開號CN102161978B)提供了一株新菌種 紅球菌ZJPH1003以及利用該菌種催化不對稱水解制備S-(+)-2, 2-二甲基環(huán)丙烷甲酸的方 法。本發(fā)明提出了利用紅球菌ZJPH1003菌株生物轉(zhuǎn)化姜黃素制備兩種姜黃素衍生物的新 方法。本發(fā)明利用紅球菌ZJPH1003靜息細胞為催化劑轉(zhuǎn)化姜黃素制備其衍生物，不僅可消 除培養(yǎng)基成分對姜黃素生物轉(zhuǎn)化的影響，有效控制轉(zhuǎn)化液的組成，提高轉(zhuǎn)化率，而且更利于 姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的后續(xù)分離與提純。本發(fā)明采用的菌種易培養(yǎng)，含酶源細胞的制備成本低， 并且催化轉(zhuǎn)化姜黃素的底物濃度高，轉(zhuǎn)化產(chǎn)率高。采用微生物轉(zhuǎn)化法對天然產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu) 修飾具有區(qū)域選擇性和立體選擇性高，反應(yīng)條件溫和、操作簡單、成本低廉，環(huán)境友好等優(yōu) 點，且生物體系可產(chǎn)生多種性質(zhì)與功能各異的酶，從而可催化姜黃素底物轉(zhuǎn)化生成具有不 同取代方式的系列衍生物，有望從中找到活性更好或具有新結(jié)構(gòu)的姜黃素衍生物，并且對 姜黃素"構(gòu)效關(guān)系"研宄具有重要的意義。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一種姜黃素衍生物的制備方法，特別是利用紅球菌ZJPH1003 生物轉(zhuǎn)化制備六氫姜黃素和八氫姜黃素，利用紅球菌ZJPH1003靜息細胞轉(zhuǎn)化姜黃素制備 其衍生物，不僅可消除培養(yǎng)基成分對生物轉(zhuǎn)化過程的影響，有效控制轉(zhuǎn)化液的組成，提高轉(zhuǎn) 化率，而且更利于姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的后續(xù)分離與提純，菌種易培養(yǎng)，含酶源細胞的制備成本 低，并且催化轉(zhuǎn)化姜黃素的底物濃度高，轉(zhuǎn)化產(chǎn)率高。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明提供一種姜黃素衍生物的制備方法，所述的方法為：以紅球菌 (Rhodococcus sp.) ZJPH1003經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源，以姜黃素為底物，于pH值 5. 4~8. 0的磷酸緩沖液中構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，在25~35°C、150~250rpm條件下（優(yōu)選30°C、 200rpm)進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液進行后處理，獲得姜黃素衍生物；所述 濕菌體的用量以菌體干重計為14. 4~50. 5g/L轉(zhuǎn)化體系，所述姜黃素底物的初始濃度為 10~250mg/L轉(zhuǎn)化體系。
[0009] 本發(fā)明所述紅球菌（Rhodococcus sp. ) ZJPH1003保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，地址為中國，武漢，武漢大學，郵編430072,保藏編號為CCTCC NO. M2010371，保藏日期 2010年12月29日，該菌株已在先前的專利申請（申請?zhí)枮?011100259864,申請日2011 年1月25日）中公開。
[0010] 進一步，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液的后處理方法為：反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液離心，取上清液 用乙酸乙酯萃取，將萃取液減壓蒸餾除去乙酸乙酯，取濃縮物進行硅膠柱層析，TLC法跟蹤 檢測，分別收集Rf值為〇. 329和0. 505時的洗脫液，蒸除溶劑，分別獲得八氫姜黃素和六氫 姜黃素。
[0011] 進一步，優(yōu)選所述濕菌體的用量以菌體干重計為21. 6~50. 5g/L轉(zhuǎn)化體系，所述 姜黃素底物的初始濃度為50~250mg/L轉(zhuǎn)化體系。
[0012] 進一步，所述用于制備八氫姜黃素的酶源按如下方法制備：
[0013] (1)斜面培養(yǎng)：將紅球菌ZJPH1003接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)3~4天，獲得斜 面菌體，所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵母膏1~ 6g/L、（NH 4)2S043 ~8g/L、KH2PO4O. 2 ~I. 5g/L、K2HPO4O. 2 ~I. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0· 1 ~ 1. 0g/L、NaCl 0· 1~I. 0g/L、瓊脂20~40g/L，pH 5~8,溶劑為水；優(yōu)選斜面培養(yǎng)基終濃 度組成為：葡萄糖 l〇g/L，蛋白胨 5. 0g/L，酵母膏 3. 0g/L，（NH4)2SO4 4. 0g/L，KH2PO4L 0g/L， K2HPO4L 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，瓊脂 30g/L，溶劑為水，pH 7· 0 ;
[0014] (2)種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑選一環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基中，30°C、200rpm培養(yǎng) 24h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵 母膏 1 ~6g/L、（NH4)2S043 ~8g/L、KH2P040. 2 ~I. 5g/L、K2HP040. 2 ~I. 5g/L、MgS04 · 7H20 0· 1 ~I. 0g/L、NaCl 0· 1 ~I. 0g/L，pH 5 ~8,溶劑為水；
[0015] (3)發(fā)酵培養(yǎng)：以體積濃度5~15%接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C、 200rpm發(fā)酵培養(yǎng)56h，將發(fā)酵培養(yǎng)液離心，收集濕菌體，即獲得所述酶源；所述發(fā)酵培養(yǎng)基 終濃度組成為：葡萄糖5~50g/L、酵母膏5~50g/L、Li 2SO4O. 1~0· 5g/L、KH2PO4O. 5~ 3. 0g/L、K2HPO4O. 5 ~3. 0g/L、MgSO4 · 7H20 0· 2 ~I. 0g/L、NaCl 0· 2 ~I. 0g/L，pH 5 ~8， 溶劑為水；
[0016] 本發(fā)明所述酶源制備過程中用于高產(chǎn)八氫姜黃素的發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選為：葡 萄糖 35 ~45g/L、酵母膏 15 ~25g/L、Li2S040. 1 ~0· 3g/L、KH2P04l. 0 ~2. 0g/L、K2HP04l. 0 ~ 2. 0g/L、MgS04 · 7H20 0· 4 ~0· 8g/L、NaCl 0· 4 ~0· 8g/L，pH 5 ~8,溶劑為水，最優(yōu)選為葡 萄糖 40g/L、酵母膏 20g/L、Li2SO4O. 2g/L、KH2PO4L 5g/L、K2HPO4L 5g/L、MgSO4 · 7H20 0· 6g/ L、NaCl 0· 6g/L，pH 7. 0,溶劑為水。
[0017] 本發(fā)明所述用于制備六氫姜黃素的酶源按如下方法制備：
[0018] (1)斜面培養(yǎng)：將紅球菌ZJPH1003接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)3~4天，獲得斜 面菌體，所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵母膏1~ 6g/L、（NH 4)2S043 ~8g/L、KH2PO4O. 2 ~I. 5g/L、K2HPO4O. 2 ~I. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0· 1 ~ 1.0 g/L、NaCl 0· 1 ~1.0 g/L、瓊脂 20 ~40g/L，pH 5 ~8,溶劑為水；
[0019] (2)種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑選一環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm培 養(yǎng)24h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、 酵母膏 1 ~6g/L、（NH4)2S043 ~8g/L、KH2P040. 2 ~I. 5g/L、K2HP040. 2 ~I. 5g/L、MgS04 ·7Η20 0. 1~1.0 g/L、NaCl 0. 1~1.0 g/L，pH 5~8,溶劑為水；優(yōu)選種子培養(yǎng)基終濃度組成為： 葡萄糖 l〇g/L，蛋白胨 5. 0g/L，酵母膏 3. 0g/L，（NH4) 2S044. 0g/L，KH2PO4L 0g/L，K2HPO4L Og/ L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，溶劑為水，pH 7· 0 ;
[0020] (3)發(fā)酵培養(yǎng)：以體積濃度10%接種量將種子液接種到裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的 250mL搖瓶中，30°C、200rpm培養(yǎng)56h，得到發(fā)酵液，離心，收集濕菌體即獲得所述酶源；所述 發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖5~50g/L、蛋白胨5~50g/L、（NH 4)2SO4O. 5~3. 0g/L、 K2HPO4L 0 ~4. 0g/L、MgSO4 · 7H20 0· 2 ~I. 0g/L、NaCl 0· 2 ~I. 0g/L，pH 5 ~8,溶劑為 水；
[0021] 本發(fā)明所述酶源制備過程中用于高產(chǎn)六氫姜黃素的發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選為： 葡萄糖 30 ~40g/L、蛋白胨 15 ~25g/L、（NH4)2SO4O. 5 ~I. 5g/L、Κ2ΗΡ042· 5 ~3. 5g/L、 MgS04.7H20 0.4~0.8g/L、NaCl 0.4~0.8g/L，pH 5~8,溶劑為水，最優(yōu)選為葡萄糖 35g/L，蛋白胨 20g/L，（NH4)2SO4L 0g/L，Κ2ΗΡ043· 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 6g/L，NaCl 0· 6g/L， pH 7.0,溶劑為水。
[0022] 進一步，所述紅球菌ZJPH1003在生物轉(zhuǎn)化制備姜黃素衍生物中應(yīng)用，具體為轉(zhuǎn)化 制備八氫姜黃素的應(yīng)用按如下步驟進行：將紅球菌ZJPH1003發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體和姜 黃素置于PH值為5. 4~8. 0磷酸緩沖液中構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，在30°C、200rpm條件下進行轉(zhuǎn)化 反應(yīng)36h，反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液離心，取上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并所有萃取液，減 壓濃縮至干除去乙酸乙酯，取濃縮物用色譜甲醇溶解后進行硅膠柱層析，以體積比2:18:1 的正己烷、二氯甲烷和甲醇混合液為洗脫劑，TLC法跟蹤檢測，收集R f值為0. 329時的洗脫 液，將洗脫液于50°C下水浴蒸除溶劑，獲得所述姜黃素衍生物，即八氫姜黃素；所述紅球菌 ZJPH1003發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體的用量以菌體干重計為28. 9~50. 5g/L轉(zhuǎn)化體系，所述姜 黃素底物的初始濃度為50~200mg/L轉(zhuǎn)化體系。
[0023] 進一步，所述紅球菌ZJPH1003在生物轉(zhuǎn)化制備姜黃素衍生物中應(yīng)用，具體為轉(zhuǎn)化 制備六氫姜黃素的應(yīng)用按如下步驟進行：將紅球菌ZJPH1003發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體和姜 黃素置于PH值為5. 8~7. 4磷酸緩沖液