， pH6. 6的磷酸鹽緩沖液中構(gòu)成反應(yīng)體系，濕菌體加入量以菌體濕重計為200g/L反應(yīng)體系。
[0140] 將各組實驗反應(yīng)體系在30°C、200rpm條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液 離心除去菌體，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C減壓濃縮至干除去乙酸乙 酯，各組旋蒸后所得濃縮物用0. 75ml色譜甲醇重新溶解后，制成樣品，用實施例1中的HPLC 法進(jìn)行檢測，未檢測到八氫姜黃素和六氫姜黃素產(chǎn)物。
[0141] 結(jié)論：熱帶假絲酵母IFFI 01254不能轉(zhuǎn)化姜黃素制備得到六氫姜黃素和八氫姜 黃素。
[0142] 實施例55 :細(xì)菌耐酪氨酸冢村氏菌E105對姜黃素生物轉(zhuǎn)化活性的考察
[0143] (1)耐酪氨酸冢村氏菌（Tsukamurella tyrosinosolvens) El〇5 保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072,保藏編號為CCTCC NO. M209306,保藏日期2009年12月16日，該菌株已在先前的專利申請（申請?zhí)枮?200910155776. X，申請日2009年12月25日）中公開。
[0144] (2)斜面培養(yǎng)：將耐酪氨酸冢村氏菌E105接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)2~ 3天，獲得斜面菌體；斜面培養(yǎng)基組成：葡萄糖10g/L，蛋白胨5. Og/L，酵母膏2. Og/L， (NH4) 2S042. 0g/L，K2HP042. Og/L，KH2PO4L Og/L，MgSO4 ·7Η20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，瓊月旨 20g/ L，pH 7.0,溶劑為水。
[0145] (3)種子培養(yǎng)：將斜面菌體接種至種子培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)24h，獲得種子液；種子培 養(yǎng)基組成：葡萄糖 l〇g/L，蛋白胨 5. 0g/L，酵母膏 2. 0g/L，（NH4)2S042. 0g/L，K2HP042. 0g/L， KH2PO4L 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 5g/L，pH 7. 0,溶劑為水。
[0146] (4)發(fā)酵培養(yǎng)：取種子液以體積濃度4%的接種量接種至裝有80mL發(fā)酵培養(yǎng)基的 250mL搖瓶中，30°C培養(yǎng)36h，獲得濕菌體；發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖15g/L，酵母膏12. Ig/ L，NH4Cl 9. 5g/L，Κ2ΗΡ042· 0g/L，KH2PO4L 0g/L，MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，NaCl 0· 6g/L，pH 7. 0， 溶劑為水。
[0147] (5)姜黃素的生物轉(zhuǎn)化：
[0148] 實驗組：將耐酪氨酸冢村氏菌E105濕菌體移入0. 1M，pH 6. 6的磷酸鹽緩沖液中， 同時加入姜黃素底物構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，姜黃素初始濃度為50mg/L轉(zhuǎn)化體系，濕菌體加量以菌 體濕重計為200g/L轉(zhuǎn)化體系。
[0149] 設(shè)置對照組1 (不添加濕菌體）：將姜黃素加入到0. 1M，pH 6. 6的磷酸鹽緩沖液中 構(gòu)成反應(yīng)體系，使其終濃度為50mg/L反應(yīng)體系。
[0150] 設(shè)置對照組2 (不添加底物）：將耐酪氨酸冢村氏菌E105濕菌體加入到0. 1M，pH 6. 6的磷酸鹽緩沖液中構(gòu)成反應(yīng)體系，濕菌體加入量以菌體濕重計為200g/L反應(yīng)體系。
[0151] 將各組實驗反應(yīng)體系在30°C、200rpm條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液 離心除去菌體，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50°C減壓濃縮至干除去乙酸乙 酯，各組旋蒸后所得濃縮物用0. 75ml色譜甲醇重新溶解后，制成樣品，用實施例1中的HPLC 法進(jìn)行檢測，未檢測到八氫姜黃素和六氫姜黃素產(chǎn)物。
[0152] 結(jié)論：細(xì)菌耐酪氨酸冢村氏菌E105不能轉(zhuǎn)化姜黃素制備得到六氫姜黃素和八氫 姜黃素。
【主權(quán)項】
1. 一種姜黃素衍生物的制備方法，其特征在于所述的方法為：以紅球菌ZJPH1003經(jīng)發(fā) 酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源，以姜黃素為底物，于pH值5. 4~8.O的磷酸緩沖液中構(gòu)成轉(zhuǎn) 化體系，在25~35°C、150~250rpm條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液進(jìn)行 后處理，獲得姜黃素衍生物；所述濕菌體的用量以菌體干重計為14. 4~50. 5g/L轉(zhuǎn)化體系， 所述姜黃素底物的初始濃度為10~250mg/L轉(zhuǎn)化體系。2. 如權(quán)利要求1所述姜黃素衍生物的制備方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)液的后處理 方法為：反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液離心，取上清液用乙酸乙酯萃取，將萃取液減壓蒸餾除去乙 酸乙酯，取濃縮物進(jìn)行硅膠柱層析，TLC法跟蹤檢測，收集Rf值為0. 329和0. 505的洗脫液， 蒸除溶劑，分別獲得八氫姜黃素和六氫姜黃素。3. 如權(quán)利要求1所述姜黃素衍生物的制備方法，其特征在于所述濕菌體的用量以菌體 干重計為21. 6~50. 5g/L轉(zhuǎn)化體系，所述姜黃素底物的初始濃度為50~250mg/L轉(zhuǎn)化體 系。4. 如權(quán)利要求1所述姜黃素衍生物的制備方法，其特征在于所述姜黃素衍生物的制備 方法為：將紅球菌ZJPH1003發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體和姜黃素置于pH值為5. 4~8. 0磷酸 緩沖液中構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，在30°C、200rpm條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)36h，反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液 離心，取上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并所有萃取液，將萃取液減壓濃縮至干，除去乙酸 乙酯，取濃縮物用色譜甲醇溶解后進(jìn)行硅膠柱層析，以體積比2:18:1的正己烷、二氯甲烷 和甲醇混合液為洗脫劑，TLC法跟蹤檢測，收集Rf值為0. 329時的洗脫液，將洗脫液于50°C 下水浴蒸除溶劑，獲得所述姜黃素衍生物，即八氫姜黃素；所述紅球菌ZJPH1003發(fā)酵培養(yǎng) 獲得的濕菌體的用量以菌體干重計為28. 8~50. 5g/L轉(zhuǎn)化體系，所述姜黃素底物的初始濃 度為50~200mg/L轉(zhuǎn)化體系。5. 如權(quán)利要求1所述姜黃素衍生物的制備方法，其特征在于所述姜黃素衍生物的制備 方法為：將紅球菌ZJPH1003發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體和姜黃素置于pH值為5. 8~7. 4磷酸 緩沖液中構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，在30°C、200rpm條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液 離心，取上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并所有萃取液，將萃取液減壓濃縮至干，除去乙酸 乙酯，取濃縮物用色譜甲醇溶解后進(jìn)行硅膠柱層析，以體積比2:18:1的正己烷、二氯甲烷 和甲醇混合液為洗脫劑，TLC法跟蹤檢測，收集Rf值為0. 505時的洗脫液，將洗脫液于50°C 下水浴蒸除溶劑，獲得所述姜黃素衍生物，即六氫姜黃素；所述紅球菌ZJPH1003發(fā)酵培養(yǎng) 獲得的濕菌體的用量以菌體干重計為28. 8~50. 5g/L轉(zhuǎn)化體系，所述姜黃素底物的初始濃 度為50~200mg/L轉(zhuǎn)化體系。6. 如權(quán)利要求4所述姜黃素衍生物的制備方法，其特征在于所述酶源按如下方法制 備： (1) 斜面培養(yǎng)：將紅球菌ZJPH1003接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)3~4天，獲得斜面菌 體，所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵母膏1~6g/ L、（NH4)2SO4 3 ~8g/L、KH2PO4 0? 2 ~I. 5g/L、K2HPO4 0? 2 ~I. 5g/L、MgSO4 ? 7H20 0? 1 ~ I.Og/L、NaCl0? 1 ~I.Og/L、瓊脂 20 ~40g/L，pH5 ~8,溶劑為水； (2) 種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑選一環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm培 養(yǎng)24h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~IOg/ L、酵母膏 1 ~6g/L、（NH4)2SO4 3 ~8g/L、KH2PO4 0? 2 ~I. 5g/L、K2HPO4O. 2 ~I. 5g/L、 MgSO4 ? 7H200. 1 ~I.Og/L、NaCl0? 1 ~I.Og/L，pH5 ~8,溶劑為水； (3)發(fā)酵培養(yǎng)：以體積濃度5~15 %接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 °C、 200rpm發(fā)酵培養(yǎng)56h，將發(fā)酵培養(yǎng)液離心，收集濕菌體，即獲得所述酶源；所述發(fā)酵培養(yǎng)基 終濃度組成為：葡萄糖5~50g/L、酵母膏5~50g/L、Li2S040. 1~0? 5、KH2P040. 5~3.Og/ L、K2HPO4 0? 5 ~3.Og/L、MgSO4 ? 7H20 0? 2 ~I.Og/L、NaCl0? 2 ~I.Og/L，pH5 ~8,溶劑 為水。7.如權(quán)利要求5所述姜黃素衍生物的制備方法，其特征在于所述酶源按如下方法制 備： (1) 斜面培養(yǎng)：將紅球菌ZJPH1003接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)3~4天，獲得斜面菌 體，所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵母膏1~6g/ L、（NH4)2SO4 3 ~8g/L、KH2PO4 0? 2 ~I. 5g/L、K2HPO4 0? 2 ~I. 5g/L、MgSO4 ? 7H20 0? 1 ~ I. 0g/L、NaCl0? 1 ~I. 0g/L、瓊脂 20 ~40g/L，pH5 ~8,溶劑為水； (2) 種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑選一環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm培養(yǎng) 24h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖5~30g/L、蛋白胨1~10g/L、酵 母膏 1 ~6g/L、（NH4)2SO4 3 ~8g/L、KH2P04 0? 2 ~I. 5g/L、K2HP04 0? 2 ~I. 5g/L、MgS04.7H20 0? 1 ~I. 0g/L、NaCl0? 1 ~I. 0g/L，pH5 ~8,溶劑為水； (3) 發(fā)酵培養(yǎng)：以體積濃度10%接種量將種子液接種到裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的 250mL搖瓶中，30°C、200rpm培養(yǎng)56h，得到發(fā)酵液，離心，收集濕菌體即獲得所述酶源；所述 發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖5~50g/L、蛋白胨5~50g/L、（NH4)2SO4 0? 5~3. 0g/L、 K2HPO4 1. 0 ~4. 0g/L、MgSO4 ? 7H20 0? 2 ~I. 0g/L、NaCl0? 2 ~I. 0g/L，pH5 ~8,溶劑為 水。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種姜黃素衍生物的制備方法，所述的方法為：以紅球菌ZJPH1003經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源，以姜黃素為底物，于pH值5.4～8.0的磷酸緩沖液中，在25～35℃、150～250rpm條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液進(jìn)行后處理，獲得姜黃素衍生物；本發(fā)明利用紅球菌ZJPH1003菌株靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法對姜黃素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，由此獲得相應(yīng)的衍生物。姜黃素結(jié)構(gòu)修飾物的藥理或生物活性較修飾前的姜黃素底物有不同程度的改善，有利于藥物新制劑的開發(fā)；本發(fā)明采用微生物轉(zhuǎn)化方法獲得姜黃素衍生物的工藝過程較簡單，環(huán)境友好，生物催化劑為微生物菌體，可以自行發(fā)酵生產(chǎn)，質(zhì)量穩(wěn)定，成本低廉。
【IPC分類】C12R1/01, C12P7/22, C12P7/26
【公開號】CN104894173
【申請?zhí)枴緾N201410795155
【發(fā)明人】王普, 黃金, 羅楊春
【申請人】浙江工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2014年12月18日