用于制備閉合線狀dna的體外無(wú)細(xì)胞方法的試劑盒的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年2月1日的題為"閉合線狀DNA的制備"的中國(guó)專利申 請(qǐng)?zhí)?01080006024. 8的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一種用于制備閉合線狀脫氧核糖核酸（DNA)的體外、無(wú)細(xì)胞方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 用于大量擴(kuò)增DNA的傳統(tǒng)的基于細(xì)胞的方法成本較高。例如，細(xì)菌的使用需要它 們?cè)诎嘿F的發(fā)酵罐內(nèi)大體積生長(zhǎng)，發(fā)酵罐需要保持在無(wú)菌狀態(tài)以防止培養(yǎng)物的污染。還需 要裂解細(xì)菌以釋放擴(kuò)增的DNA并且需要將所述DNA從其他細(xì)菌組分中清洗并且純化出來(lái)。 特別是在制備DNA疫苗或其他治療性DNA藥物時(shí)，需要高純度以除去對(duì)哺乳動(dòng)物具有毒性 的內(nèi)毒素。
[0004] 除了成本問(wèn)題之外，細(xì)菌的使用在許多情況下為擴(kuò)增方法的保真度造成困難。在 細(xì)菌細(xì)胞復(fù)雜的生物化學(xué)環(huán)境中，難以控制所需DNA產(chǎn)物的質(zhì)量和收率。細(xì)菌有時(shí)會(huì)改變 克隆在擴(kuò)增DNA中的所需基因并且使其對(duì)于所需目的無(wú)用。重組事件還可能會(huì)導(dǎo)致感興趣 的DNA的忠實(shí)制備中存在問(wèn)題。用于擴(kuò)增DNA的無(wú)細(xì)胞酶法避免了使用宿主細(xì)胞，所以是 有利的。
[0005] 例如，制備藥用DNA表達(dá)盒幾乎不例外地依賴于將它們插入細(xì)菌質(zhì)粒并且在細(xì)菌 發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行擴(kuò)增。
[0006] 該現(xiàn)有技術(shù)方法在許多方面限制了改進(jìn)此類(lèi)DNA藥物制備的機(jī)會(huì)。此外，質(zhì)粒產(chǎn) 物主要是粗DNA分子，因?yàn)槠浒幱霉δ懿恍枰暮塑账嵝蛄?。因此，在制備DNA產(chǎn)物例 如DNA藥物的領(lǐng)域中，需要提供用于大量擴(kuò)增DNA的改進(jìn)方法。特別是需要提供用于擴(kuò)增 特定形式的DNA例如閉合線狀DNA的改進(jìn)方法。由于閉合線狀DNA分子與其他形式的DNA 相比具有更高的穩(wěn)定性和安全性，所以在治療應(yīng)用中具有特別的用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明涉及體外、無(wú)細(xì)胞制備線狀共價(jià)閉合DNA(閉合線狀DNA)的方法。該方法 與涉及細(xì)胞處理和在質(zhì)粒內(nèi)擴(kuò)增的傳統(tǒng)方法相比能夠增強(qiáng)線狀共價(jià)閉合DNA的制備。這顯 著增加了該方法的生產(chǎn)力并同時(shí)降低產(chǎn)品純化的成本。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明，在無(wú)宿主細(xì)胞的條件下用酶從DNA模板制備線狀共價(jià)閉合DNA。該模 板DNA包含至少一個(gè)原核端粒酶（protelomerase，一種菌體編碼的酶）祀序列。使該模 板DNA與至少一種DNA聚合酶在促進(jìn)該模板擴(kuò)增的條件下在一種或多種引物存在下接觸。 使從該模板擴(kuò)增的DNA與至少一種原核端粒酶在促進(jìn)閉合線狀DNA制備的條件下接觸。
[0009] 因此，本發(fā)明提供用于制備閉合線狀脫氧核糖核酸（DNA)的體外無(wú)細(xì)胞方法，其 包括：
[0010] (a)使包含至少一個(gè)原核端粒酶靶序列的DNA模板與至少一種DNA聚合酶在一種 或多種引物存在下在促進(jìn)所述模板擴(kuò)增的條件下接觸；和
[0011] (b)使（a)中制備的擴(kuò)增DNA與至少一種原核端粒酶在促進(jìn)閉合線狀DNA制備的 條件下接觸。
[0012] 本發(fā)明還涉及提供對(duì)于本發(fā)明方法必要的組分的試劑盒。因此，本發(fā)明提供包含 至少一種DNA聚合酶和至少一種原核端粒酶以及本發(fā)明方法的使用說(shuō)明的試劑盒。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1 :噬菌體中線狀共價(jià)閉合DNA的復(fù)制以及原核端粒酶的作用。A.染色體外噬 菌體線狀共價(jià)閉合DNA的示意圖。*=端粒回文序列的中心。R序列是L序列的反轉(zhuǎn)回文重 復(fù)。B.宿主內(nèi)噬菌體DNA的復(fù)制：泡表示DNA鏈復(fù)制。對(duì)于R和L的互補(bǔ)鏈的合成得到了 相同的雙鏈RL序列。C.在原核端粒酶作用下形成的產(chǎn)物。原核端粒酶結(jié)合至RL序列并且 在回文序列的中心點(diǎn)切割并連接相反鏈從而重新形成端粒并且完成原始線狀共價(jià)閉合DNA 的復(fù)制。
[0014] 圖2 :大腸桿菌噬菌體N15原核端粒酶（TelN)對(duì)包含其靶位點(diǎn)telRL的環(huán)狀雙鏈 DNA的作用。TelRL是具有由箭頭指出的28bp右臂（telR)和左臂（telL)的反轉(zhuǎn)回文序列。 下劃線示出的序列表示telRL回文序列中的缺陷。中間22bp的完整反轉(zhuǎn)回文序列TelO對(duì) 于酶TelN的結(jié)合是必需的。TelN在其中點(diǎn)裂解該22bp序列并且將互補(bǔ)序列的末端連接形 成共價(jià)閉合末端。
[0015] 圖3 :比較存在于各種生物體中的原核端粒酶靶序列。加框序列表示完整的或不 完整的回文序列的范圍。下劃線表示該回文序列中的缺陷。突出顯示的堿基對(duì)序列是所有 原核端粒酶靶序列共有的，表明它們對(duì)于原核端粒酶結(jié)合和發(fā)揮作用的重要性。A.大腸桿 菌菌體N15。B.克雷伯氏菌屬（Klebsiella) 菌體Phi K02。C.耶爾森菌屬（Yersinia) 菌體Py54。D.鹽單胞菌屬（Halomonas) 菌體Phi HAP。E.弧菌屬（Vibrio) 菌體 VP882。F.伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi)質(zhì)粒1ρΒ31. 16。加框序列表示每一種 噬菌體的完整或不完整的回文序列的范圍。G.示出了用于噬菌體原核端粒酶結(jié)合并發(fā)揮作 用的共有反轉(zhuǎn)回文序列。其為具有22個(gè)堿基對(duì)的完整反轉(zhuǎn)重復(fù)序列（切割位點(diǎn)每一邊各 11個(gè)堿基對(duì)）。該共有序列衍生自A-E的突出顯示的保守殘基。顯示出保守堿基對(duì)以及它 們?cè)诨匚男蛄兄械奈恢?。短橫線表示序列組成中的可變性，即堿基可能為N(A、T、C或G)的 情況。
[0016] 圖4 :使用RCA鏈置換DNA聚合酶以及TelN原核端粒酶體外擴(kuò)增線狀雙鏈共價(jià)閉 合DNA的具體方法。A.閉合線狀DNA模板。R和L表示TelN原核端粒酶結(jié)合序列的右臂 和左臂的DNA序列。B.起始模板變性形成環(huán)狀單鏈DNA。C.引物結(jié)合。D-E.通過(guò)RCA鏈 置換DNA聚合酶從單鏈DNA模板進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。F.形成長(zhǎng)多聯(lián)體雙鏈DNA，其包含被原核 端粒酶結(jié)合序列（RU分離的單個(gè)單元的已擴(kuò)增模板。G.與對(duì)RL序列具有特異性的TelN 原核端粒酶接觸。原核端粒酶在RL位點(diǎn)裂解多聯(lián)體DNA并且連接互補(bǔ)鏈以產(chǎn)生原始線狀 共價(jià)閉合DNA模板的擴(kuò)增拷貝。
[0017] 圖5 :從長(zhǎng)雙鏈DNA分子切割表達(dá)感興趣的基因的DNA表達(dá)盒以產(chǎn)生閉合線狀DNA 表達(dá)盒。A.線狀雙鏈DNA分子，其包含的DNA表達(dá)盒包含感興趣的基因，其兩側(cè)側(cè)接原核端 粒酶靶序列。B.以線狀共價(jià)閉合DNA分子切割所述DNA表達(dá)盒。
[0018] 圖6 :擴(kuò)增閉合線狀DNA和用于"狗骨狀（doggybone)"表達(dá)盒的報(bào)告基因表達(dá)。
[0019] A.通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RCA擴(kuò)增的多聯(lián)體的TelN裂解以形成閉合線狀DNA。 泳道1-3表示RCA擴(kuò)增的pUC18。泳道1 :3微升未消化的RCA擴(kuò)增的pUC18。泳道2 :2微 升用Pvul消化的RCA擴(kuò)增的pUC18。泳道3 :2微升用TelN處理的RCA擴(kuò)增的pUC18 (陰 性對(duì)照）。泳道4-6表示RCA擴(kuò)增的pUC18telRL。泳道4 :3微升未消化的RCA擴(kuò)增的 pUC18telRL。泳道5 :1微升用Pvul消化的RCA擴(kuò)增的pUC18telRL。泳道6 :4微升用TelN 處理的RCA擴(kuò)增的pUC18telRL。示出了用TelN處理生成的2. 7kb閉合線狀DNA。兩側(cè)的 泳道為DNA大小標(biāo)準(zhǔn)物。
[0020] B.顯示閉合線狀DNA對(duì)熱變性的耐性的Lab-On-A-Chip(LOC)分析。泳道I :DNA 大小標(biāo)準(zhǔn)物。泳道2和3 :100ng PCR DOG。泳道4和5 :100ng變性的PCR DOG。泳道6和 7 :"狗骨狀" DNA-用TelN處理的IOOng pGL D0G。泳道6和7 :"狗骨狀DNA" -用TelN處 理并且變性的IOOng pGL D0G。
[0021] C.通過(guò)轉(zhuǎn)染驗(yàn)證閉合線狀DNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。y軸：平均螢火蟲(chóng)/海腎比 (Firefly/Renilla ratio) ;χ-軸：在轉(zhuǎn)染中使用的線狀DNA構(gòu)建體。PCR pGL:來(lái)自Iuc基 因中的PGL4. 13的開(kāi)放線狀PCR片段。PCR DOG :用側(cè)接telRL位點(diǎn)的引物從pGL DOG擴(kuò)增 的開(kāi)放線狀PCR片段。"狗MP":分離自用PvuI消化（除去污染性載體DNA)并且用TelN裂 解的小量制備DNA的pGL DOG的閉合線狀DNA。"狗RCA":用PvuI消化并且用TelN裂解的 通過(guò)RCA擴(kuò)增的pGL DOG的閉合線狀DNA。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 序列描述
[0023] SEQ ID NO: 1是桿菌屬噬菌體phi29DNA聚合酶的核酸序列。
[0024] SEQ ID NO:2是由SEQ ID NO: 1編碼的桿菌屬噬菌體phi29DNA聚合酶的氨基酸序 列。
[0025] SEQ ID NO:3是火球菌屬（Pyrococcus sp)Deep Vent DNA聚合酶的氨基酸序列。
[0026] SEQ ID NO: 4 是嗜熱脂肪芽胞桿菌（Bacillus stearothermophilus) DNA 聚合酶 I 的核酸序列。
[0027] SEQ ID N0:5是由SEQ ID N0:4編碼的嗜熱脂肪芽胞桿菌DNA聚合酶I的氨基酸 序列。
[0028] SEQ ID NO:6是鹽單胞菌屬（Halomonas)噬菌體phiHAP-Ι原核端粒酶核酸序列的 核酸序列。
[0029] SEQ ID N0:7是由SEQ ID N0:6編碼的鹽單胞菌屬噬菌體phiHAP-Ι原核端粒酶的 氨基酸序列。
[0030] SEQ ID NO:8是耶爾森菌屬（Yersinia)噬菌體PY54原核端粒酶的核酸序列。
[0031] SEQ ID N0:9是由SEQ ID N0:8編碼的耶爾森菌屬噬菌體PY54原核端粒酶的氨基 酸序列。
[0032] SEQ ID NO: 10是克雷伯氏菌屬（Klebsiella)噬菌體phiK02原核端粒酶的核酸序 列。
[0033] SEQ ID NO: 11是由SEQ ID NO: 10編碼的克雷伯氏菌屬噬菌體phiK02原核端粒酶 的氨基酸序列。
[0034] SEQ ID NO: 12是弧菌屬（Vibrio)噬菌體VP882原核端粒酶的核酸序列。
[0035] SEQ ID NO: 13是由SEQ ID NO: 12編碼的弧菌屬噬菌體VP882原核端粒酶的氨基 酸序列。
[0036] SEQ ID NO: 14是大腸桿菌噬菌體N15原核端粒酶（telN)和二次免疫阻抑物（cA) 核酸序列的核酸序列。
[0037] SEQ ID NO: 15是由SEQ ID NO: 14編碼的大腸桿菌噬菌體N15原核端粒酶（telN) 的氨基酸序列。
[0038] SEQ ID NO: 16是存在于噬菌體原核端粒酶靶序列中的完整反轉(zhuǎn)重復(fù)序列的共有 核酸序列。
[0039] SEQ ID NO: 17是來(lái)自大腸桿菌噬菌體N15和克雷伯氏菌屬噬菌體phiK02的22堿 基完整反轉(zhuǎn)重復(fù)核酸序列。
[0040] SEQ ID NO: 18是來(lái)自耶爾森菌屬噬菌體PY54的22堿基完整反轉(zhuǎn)重復(fù)核酸序列。
[0041] SEQ ID NO: 19是來(lái)自鹽單胞菌屬噬菌體phiHAP-Ι的22堿基完整反轉(zhuǎn)重復(fù)核酸序 列。
[0042] SEQ ID NO: 20是來(lái)自弧菌屬噬菌體VP882的22堿基完整反轉(zhuǎn)重復(fù)核酸序列。
[0043] SEQ ID NO:21 是來(lái)自伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi)質(zhì)粒 1ρΒ31· 16 的 14堿基完整反轉(zhuǎn)重復(fù)核酸序列。
[0044] SEQ ID NO: 22是來(lái)自弧菌屬噬菌體VP882的24堿基完整反轉(zhuǎn)重復(fù)核酸序列。
[0045] SEQ ID NO: 23是來(lái)自耶爾森菌屬噬菌體PY54的42堿基完整反轉(zhuǎn)重復(fù)核酸序列。
[0046] SEQ ID NO: 24是來(lái)自鹽單胞菌屬噬菌體phiHAP-Ι的90堿基完整反轉(zhuǎn)重復(fù)核酸序 列。
[0047] SEQ ID NO: 25是包含原核端粒酶靶序列的來(lái)自大腸桿菌噬菌體N15的核酸序列。
[0048] SEQ ID NO: 26是包含原核端粒酶靶序列的來(lái)自克雷伯氏菌屬噬菌體phiK02的核 酸序列。
[0049] SEQ ID NO: 27是包含原核端粒酶靶序列的來(lái)自耶爾森菌屬噬菌體PY54的核酸序 列。
[0050] SEQ ID NO: 28是包含原核端粒酶靶序列的來(lái)自弧菌屬噬菌體VP882的核酸序列。
[0051] SEQ ID N0:29是包含原核端粒酶靶序列的來(lái)自伯氏疏螺旋體質(zhì)粒1ρΒ31. 16的核 酸序列。
[0052] SEQ ID N0:30是用于TelN擴(kuò)增的經(jīng)修飾的寡核苷酸引物。
[0053] SEQ ID N0:31是用于TelN擴(kuò)增的經(jīng)修飾的寡核苷酸引物。
[0054] SEQ ID NO: 32是包含TelN識(shí)別位點(diǎn)telRL的合成寡核苷酸。
[0055] SEQ ID NO: 33是包含TelN識(shí)別位點(diǎn)telRL的合成寡核苷酸。
[0056] SEQ ID NO: 34是用于PCR DOG擴(kuò)增的引物序列。
[0057] SEQ ID NO: 35是用于PCR DOG擴(kuò)增的引物序列。
[0058] 本發(fā)明涉及用于制備線狀雙鏈共價(jià)閉合DNA即閉合線狀DNA分子的方法。閉合線 狀DNA分子通常包括還被描述為發(fā)