相同量的DNA。
[0180] 實(shí)施例3-駘證TelN的再連接活件和閉合線狀DNA的形成
[0181] 用變性凝膠電泳驗(yàn)證TelN裂解產(chǎn)物的閉合線狀DNA結(jié)構(gòu)。如實(shí)施例3將pGL DOG 與TelN溫育。將對應(yīng)于包含在狗骨狀（doggybone)內(nèi)的區(qū)域但是具有開放DNA末端的合 成PCR產(chǎn)物（PCR D0G)作為對照。使用側(cè)接telRL位點(diǎn)的引物從pGL DOG擴(kuò)增PCR DOG線 性片段：
[0182] Sac pGL 5' GTGCAAGTGCAGGTGCCAGAAC 3'（SEQ ID N0:34);
[0183] Bam pGL 5' GATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGC 3'（SEQ ID N0:35)
[0184] 在非變性瓊脂糖凝膠上[TAE緩沖液（40mMTriS-醋酸鹽，lmMEDTA)中0.8%瓊脂 糖]，通過將IOOng pGL DOG與TelN溫育獲得的2. 4kb裂解產(chǎn)物迀移至與PCR DOG (2. 7kb) 相似的大小，因?yàn)閮煞N產(chǎn)物仍然是雙鏈的。
[0185] 然而，當(dāng)進(jìn)行能夠?qū)㈦p鏈DNA變性并且分離成為單鏈DNA的變性瓊脂糖凝膠[在 H2O中1 %瓊脂糖，50mM Na0H、0.1 mM EDTA中電泳并且電泳后在IM Tris HCl pH 7.6、 I. 5M NaCl內(nèi)中和]時，TelN "狗骨狀"片段與開放末端PCR對照或用XmnI線性化的 pUC18telRL(均為2. 7kb)相比以更高的分子量[大約5kb]迀移。
[0186] 該迀移差異表明通過TelN形成了閉合線狀"狗骨狀"結(jié)構(gòu)。將"狗骨狀"結(jié)構(gòu)變 性會產(chǎn)生單鏈開放環(huán)，其在凝膠中比變性開放末端線狀PCR產(chǎn)物釋放的線狀單鏈迀移得更 慢。
[0187] 還可在通過芯片上實(shí)驗(yàn)室（Lab-〇n-a-Chip，L0C)毛細(xì)管電泳進(jìn)行的熱變性分析 中顯示對通過TelN形成的產(chǎn)物的閉合線狀結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證。LOC分析代表了用于快速分離生物 分子的毛細(xì)管電泳平臺。具有DNA7500芯片的Agilent生物分析儀（Agilent, UK)可用于 分離并且近似分選長達(dá)7000bp的DNA片段。
[0188] 該芯片系統(tǒng)不能檢測單鏈DNA。在低鹽條件下例如在H2O中將常規(guī)雙鏈DNA熱變 性（95°C，5mins)并且以1°C /s快速（<1°C /s)冷卻得到了不能在LOC系統(tǒng)上可視化的單 鏈DNA。然而，"狗骨狀"DNA (通過TelN裂解獲得）中共價連接的DNA末端不能在變性后分 離并且因此復(fù)性形成仍然可視的雙鏈DNA。因此比較被快速冷卻的熱變性DNA使得區(qū)分共 價閉合線狀（ccl)狗骨狀DNA和常規(guī)開放線狀（〇1)雙鏈DNA。
[0189] 在熱循環(huán)儀（Biorad I-cycler, Biorad, UK)中的薄壁PCR管內(nèi)將H2O中的DNA樣 品（IOOng)變性（95°C，5mins)并快速（<l°C/s)冷卻至4°C。對于與TelN裂解的比較，首 先在IX Tel N緩沖液中將樣品與1微升純化的原核端粒酶于30°C溫育lOmin。以相同的 但不包含酶的方法處理對照樣品。根據(jù)使用說明使用具有DNA 7500芯片的Agilent生物 分析儀分析樣品（1微升）。
[0190] 結(jié)果顯示于圖6的B中。這些結(jié)果表明通過將pGL DOG和TelN溫育獲得的閉合 線狀"狗骨狀" DNA與相當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)開放線狀DNA (PCR DOG)相比對熱變性具有抗性。使用由 RCA擴(kuò)增和TelN裂解獲得的RCA擴(kuò)增狗骨狀DNA也獲得了相同的對熱變性的抗性。
[0191] 在其他實(shí)驗(yàn)中，在開放末端PCR DOG上進(jìn)行TelN裂解。這引起形成2. 8kb的熱穩(wěn) 定裂解產(chǎn)物"狗骨狀"DNA，以及0. 09和0. 14kb的熱穩(wěn)定"狗骨狀"末端。
[0192] 在LOC分析中，與預(yù)測2. 4kb和2. 7kb近似大小的序列數(shù)據(jù)相比，"狗骨"和PCR DOG的估算大小分別為2. 8kb-3. Okb和3. 1-3. 5kb。這反映了出現(xiàn)在非變性LOC分析中基 于構(gòu)象的迀移差異。
[0193] 實(shí)施例4-從通討RCA(滾環(huán)擴(kuò)增）形成的多聯(lián)體DNA形成閉合線狀DNA
[0194] 實(shí)施用于擴(kuò)增DNA模板并將該擴(kuò)增的DNA轉(zhuǎn)化成閉合線狀"狗骨狀"DNA的體外 無細(xì)胞方法。在各種條件下通過使用來自枯草芽孢桿菌菌體phi29的phi29酶和作為引 物的隨機(jī)六聚體的RCA擴(kuò)增具有和不具有telRL位點(diǎn)的共價閉合質(zhì)粒模板。這導(dǎo)致通過 phi29的核苷酸摻入鏈置換活性擴(kuò)增多聯(lián)體DNA。根據(jù)使用說明使用TempliPhi試劑盒（GE Healthcare)進(jìn)行最初的研宄。但是之后用內(nèi)部方法（使用由NEB提供的phi29)取代該試 劑盒，得到純度增加的更高的產(chǎn)物收率。
[0195] 在 10 微升復(fù)性 / 變性緩沖液（30mM Tris-HCl pH 7.5、20mM KCl、8mM MgCl2、20 微摩爾隨機(jī)六聚體）中進(jìn)行40pg-200ng閉合環(huán)狀模板的變性和引物的退火。通過加熱至 95°C 1分鐘然后經(jīng)30min冷卻至室溫進(jìn)行變性和退火。
[0196] 然后向10微升退火的DNA/引物反應(yīng)液中加入10微升反應(yīng)緩沖液[35mM Tris-HCl、50mM KCl、14mM MgCl2、10mM(NH4)2S04、4mM DTT、10U phi29、0.002U PPi(酵母無 機(jī)焦磷酸酶）、ImM dNTP]。
[0197] 將20微升反應(yīng)液于30°C溫育18小時。將樣品在凝膠上電泳以檢驗(yàn)多聯(lián)體的形 成，然后用限制性酶或TelN消化反應(yīng)混合物以檢驗(yàn)產(chǎn)物。
[0198] 然后將通過RCA擴(kuò)增的多聯(lián)體DNA與TelN溫育。通常，將RCA擴(kuò)增的DNA底物在 水和IOx TelN緩沖液中稀釋至20微升的終體積。pUC18telRL的結(jié)果顯示于圖6的A中。
[0199] 從泳道1的凝膠可以看出，未消化的多聯(lián)體擴(kuò)增DNA形成不能進(jìn)入凝膠的網(wǎng)狀物。 然而，TelN能夠裂解RCA物質(zhì)引起2. 7kb狗骨狀片段（泳道6)的釋放。通過用Pvul限制 性消化（泳道2和5)實(shí)現(xiàn)了驗(yàn)證由RCA擴(kuò)增的DNA是用于該反應(yīng)中的起始模板。pUC18 (無 telRL)充當(dāng)TelN活性的陰性對照（泳道3)。
[0200] 相似地，在其他實(shí)驗(yàn)中，也用TelN裂解RCA生成的pGL DOG多聯(lián)體。因此，證明本 發(fā)明方法可以有效地從起始模板擴(kuò)增閉合線狀DNA。另外，有可能在連續(xù)步驟中使用RCA聚 合酶和原核端粒酶以簡單的方式擴(kuò)增閉合線狀DNA而不需要間插擴(kuò)增DNA的純化。
[0201] 實(shí)施例5-表汰擴(kuò)增的閉合線狀DNA
[0202] 用Hela細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)以研宄根據(jù)本發(fā)明生成的閉合線狀"狗骨狀"DNA的熒 光素酶報(bào)告基因的表達(dá)。將共價閉合線狀DNA和線狀PCR DOG對照作為對照。
[0203] 在20mm直徑孔內(nèi)在RPMI中于60 %匯合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并且根據(jù)使用說明使用 Transfectam? (Promega)。每一次轉(zhuǎn)染使用400ng構(gòu)建體DNA。通過在每一次轉(zhuǎn)染中包括 40ng海腎（Renilla)熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pGL4. 73(包含來自海腎的hRluc基因）作為內(nèi)對 照，將實(shí)驗(yàn)內(nèi)和實(shí)驗(yàn)之間的轉(zhuǎn)染頻率標(biāo)準(zhǔn)化。使用Dual-Luciferase? Reporter (DLRtm)測 試系統(tǒng)（Promega)依次測量螢火蟲熒光素酶（來自螢火蟲的發(fā)光）和海腎熒光素酶活性。 使用GloMax Multi光度計(jì)（Promega)測量相對光單位并且將結(jié)果表示為螢火蟲熒光素酶 /海腎熒光素酶比。所有試驗(yàn)均一式三份進(jìn)行。
[0204] 在轉(zhuǎn)染中檢測的構(gòu)建體為：
[0205] pGL4. 131uc 對照 DNA
[0206] pGL4. 73hRluc
[0207] PCR DOG
[0208] PCR對照（來自pGL4. 13跨越Iuc基因的片段）
[0209] pGL DOG (包含 2 個 telRL 位點(diǎn)的 pGL4. I3)
[0210] "狗骨狀" MP (分離自用PvuI消化（以除去污染性載體DNA)然后用TelN裂解的 小量制備DNA的pGL D0G)。
[0211] "狗骨狀" RCA (用PvuI消化然后用TelN裂解的通過RCA擴(kuò)增的pGL D0G)。
[0212] RCA pGL DOG -在pGL DOG的初始RCA擴(kuò)增中生成的多聯(lián)體DNA。
[0213] 結(jié)果示于圖6的C中。證明包括通過RCA擴(kuò)增的那些在內(nèi)的閉合線狀DNA比開放 線狀PCR構(gòu)建物表達(dá)更高水平的熒光素酶。這證明當(dāng)引入哺乳動物細(xì)胞時，根據(jù)本發(fā)明制 備的閉合線狀DNA可用于成功表達(dá)熒光素酶。
[0214] 本發(fā)明的序列
[0215] 表 A
[0216]
[0217] 表 B
[0218]
[0221]
[0222] 表 D
[0223]
[0225] 表 E
[0226]
[0227] 表 F
[0228]
[0229] 表 G
[0230]
[0231] 表 H
[0232]
[0233]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種適用于制備閉合線狀脫氧核糖核酸的體外無細(xì)胞方法的試劑盒，包含至少一種 DNA聚合酶和至少一種原核端粒酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中，所述DNA聚合酶是鏈置換型DNA聚合酶。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中，所述DNA聚合酶是滾環(huán)擴(kuò)增DNA聚合酶。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中，所述DNA聚合酶是SEQIDNO: 2的phi29或包 含與全長SEQIDNO: 2的至少80%同一性的所述phi29的變異體。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，所述原核端粒酶是SEQIDN0:15 的噬菌體N15TelN或包含與全長SEQID勵：15的至少80%同一性的所述噬菌體附5了6以 的變異體。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的試劑盒，包含dNTP、合適的緩沖劑和一種或多 種引物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述引物是隨機(jī)引物。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中，所述引物是特異性引物。9. 根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，所述引物包含化學(xué)改性的核苷 酸。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的試劑盒，包含焦磷酸酶。11. 一種用于體外無細(xì)胞制備閉合線狀DNA的方法，包括： -由包含多于一種原核端粒酶靶序列的DNA模板擴(kuò)增DNA，以及 _使擴(kuò)增的所述DNA與至少一種原核端粒酶在促進(jìn)閉合線狀DNA制備的條件下接觸。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，同時或并行進(jìn)行所述DNA模板的所述擴(kuò)增和閉 合線狀DNA的所述制備。13. 包括DNA模板的多個重復(fù)的多聯(lián)體DNA，所述DNA模板包含至少一種原核端粒酶靶 序列。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的多聯(lián)體DNA，其中，所述DNA模板包括一種或多種由原核端 粒酶靶序列側(cè)接在任一側(cè)的表達(dá)盒。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的多聯(lián)體DNA，其中，所述表達(dá)盒包含可操作地連接至編碼 mRNA或蛋白質(zhì)的序列的真核啟動子。16. 根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15所述的多聯(lián)體DNA，其中，所述表達(dá)盒進(jìn)一步包含 真核轉(zhuǎn)錄終止序列。17. 根據(jù)權(quán)利要求14至16中任一項(xiàng)所述的多聯(lián)體DNA，其中，所述表達(dá)盒缺失選自由 以下組成的組中的一種或多種細(xì)菌或載體序列： (i) 細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)； (ii) 細(xì)菌的選擇標(biāo)記；和 (iii) 未甲基化的CpG基序。18. 根據(jù)權(quán)利要求13至17中任一項(xiàng)所述的多聯(lián)體DNA，其中，所述多聯(lián)體DNA包含10 個或更多個單位的擴(kuò)增的DNA模板。19. 根據(jù)權(quán)利要求13至18中任一項(xiàng)所述的多聯(lián)體DNA，其中，所述多聯(lián)體DNA的大小 為至少5kb。20. 根據(jù)權(quán)利要求13至19中任一項(xiàng)所述的多聯(lián)體DNA，其中，所述多聯(lián)體DNA是具有 模板DNA的多個重復(fù)的線狀單鏈DNA。21. 根據(jù)權(quán)利要求13至20中任一項(xiàng)所述的多聯(lián)體DNA，其中，所述多聯(lián)體DNA是在體 外。22. 根據(jù)權(quán)利要求13至21中任一項(xiàng)所述的多聯(lián)體DNA，其中，所述DNA模板包含多于 一種原核端粒酶靶序列。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于制備閉合線狀DNA的體外無細(xì)胞方法的試劑盒。該試劑盒包含至少一種DNA聚合酶和至少一種原核端粒酶。本文還公開了一種用于制備閉合線狀脫氧核糖核酸(DNA)的體外方法，包括：(a)在一種或多種引物存在下，使包含至少一個原核端粒酶靶序列的DNA模板與至少一種DNA聚合酶在促進(jìn)述模板擴(kuò)增的條件下接觸；和(b)使(a)中制備的擴(kuò)增DNA與至少一種原核端粒酶在促進(jìn)閉合線狀DNA制備的條件下接觸。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN104911177
【申請?zhí)枴緾N201510314041
【發(fā)明人】瓦薩·希爾
【申請人】觸光基因?qū)W有限公司
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2010年2月1日
【公告號】CA2751130A1, CN102301010A, CN102301010B, EP2391731A1, EP2391731B1, EP2612925A1, US9109250, US20120282283, US20150329902, WO2010086626A1