重組微生物和其用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及重組微生物和用于通過微生物發(fā)酵包含CO的底物來生產MEK和/或 2_ 丁醇的方法。
【背景技術】
[0002] 2- 丁醇是大規(guī)模生產的有機化合物，主要作為工業(yè)溶劑甲基乙基酮（MEK或丁酮） 的前體。其通常通過利用硫酸催化劑的水合作用從石油化學產品（丁烯）生產。
[0003] MEK是油漆和墨水中的重要成分，具有正在以每年1.9 %增長的20億美元的全球 市場。作為其合成中的中間體，對2-丁醇的需求與對丁酮的需求緊密相關。重要的是，2-丁 醇也可被轉化成在合成橡膠、樹脂和粘著劑中使用的1，3-丁二烯。1，3-丁二烯的全球市場 超過190億美元，并且正在以每年2. 7%增長。比乙醇更能量密集的2-丁醇也具有作為燃 料以及作為丁二烯生產前體的潛在用途。
[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供重組微生物和一種用于通過微生物發(fā)酵來生產MEK和/ 或2- 丁醇的方法，這可以提供優(yōu)于已知方法的一種或多種優(yōu)勢，或至少提供公眾以有用的 選擇。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明在廣義上尤其提供了用于通過微生物發(fā)酵包含CO和/或CO2的底物來生 產MEK和/或2- 丁醇的方法以及用于所述方法的重組微生物。
[0006] 在第一方面中，本發(fā)明提供了一氧化碳營養(yǎng)型產乙酸重組微生物，其能夠通過發(fā) 酵包含CO的底物來產生MEK和/或2- 丁醇以及任選地一種或多種其它產物。
[0007] 在一個具體實施方案中，微生物被改造以用于表達在重組微生物所來源的親本微 生物中不存在的MEK和/或2-丁醇生物合成途徑中的一種或多種酶（或其一個或多個亞 基）。
[0008] 在另一個實施方案中，微生物被改造以用于過表達在重組微生物所來源的親本微 生物中存在的MEK和/或2- 丁醇生物合成途徑中的一種或多種酶（或其一個或多個亞基）。
[0009] 在一個實施方案中，微生物被改造以用于表達在親本微生物中不存在的MEK和/ 或2- 丁醇生物合成途徑中的一種或多種酶（或其一個或多個亞基），且過表達在親本微生 物中存在的MEK和/或2- 丁醇生物合成途徑中的一種或多種酶（或其一個或多個亞基）。
[0010] 在一個實施方案中，微生物被改造以用于表達以下酶中的一種或多種：
[0011] 催化（R)-乙偶姻轉化成（R，S)-2, 3- 丁二醇的酶；
[0012] 催化（R，S) -2, 3- 丁二醇轉化成MEK的酶；以及
[0013] 催化MEK轉化成2- 丁醇的酶。
[0014] 在一個實施方案中，微生物被改造以用于降低或基本上消除在親本微生物中存在 的一或多種酶的活性。在一個實施方案中，所述一種或多種酶是MEK和/或2-丁醇生物合 成途徑的一部分。
[0015] 在一個實施方案中，所述微生物能夠通過發(fā)酵包含CO的底物來產生2- 丁醇，并且 被改造用于表達或過表達2- 丁醇生物合成途徑中的選自以下的一種或多種酶：
[0016] (S) -2, 3- 丁二醇脫氫酶；
[0017] 二醇/甘油脫水酶；
[0018] 醇脫氫酶；以及，
[0019] 其中任何一種或多種的功能上等效的變體。
[0020] 在一個實施方案中，所述親本微生物缺乏（S)-2, 3-丁二醇脫氫酶和二醇/甘油脫 水酶或其中任何一種或多種的功能上等效的變體，并且所述重組微生物被改造用于表達這 兩種酶。
[0021] 在一個實施方案中，所述親本微生物包含（R)-2, 3-丁二醇脫氫酶或其功能上等 效的變體，并且所述重組微生物被改造用于降低或基本上消除這種酶的活性。
[0022] 在一個實施方案中，所述微生物能夠通過發(fā)酵包含CO的底物來產生MEK并且被改 造用于表達或過表達MEK生物合成途徑中的選自以下的一種或多種酶：
[0023] (S) -2, 3- 丁二醇脫氫酶；
[0024] 二醇/甘油脫水酶；以及，
[0025] 其中任何一種或多種的功能上等效的變體。
[0026] 在一個實施方案中，所述親本微生物缺乏（S)-2, 3-丁二醇脫氫酶和二醇/甘油脫 水酶或其中任何一種或多種的功能上等效的變體，并且所述重組微生物被改造用于表達這 兩種酶。
[0027] 在一個實施方案中，所述親本微生物包含醇脫氫酶或其功能上等效的變體，并且 所述重組微生物被改造用于減小或基本上消除這種酶的活性。
[0028] 在一個實施方案中，所述親本微生物包含（R)_2, 3-丁二醇脫氫酶或其功能上等 效的變體，并且所述重組微生物被改造用于降低或基本上消除這種酶的活性。
[0029] 在一個實施方案中，所述微生物包含被改造以用于增加親本微生物中存在的一 種或多種核酸的表達的一種或多種外源性核酸，并且所述一種或多種核酸編碼之前本文 中提及的一種或多種酶（或其一個或多個亞基）。在一個實施方案中，一種或多種被改 造用于增加表達的外源性核酸是調控元件。在一個實施方案中，所述調控元件是啟動子。 在一個實施方案中，所述啟動子是組成型啟動子。在一個實施方案中，所述啟動子是選自 Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸轉乙酰酶/乙酸激酶操縱子啟動子。
[0030] 在一個實施方案中，所述微生物包含被改造以用于表達親本微生物中不存在的之 前本文中提及的一種或多種酶（或其一個或多個亞基）的一種或多種外源性核酸。在一個 實施方案中，所述微生物包含一種或多種外源性核酸，其編碼且被改造以用于表達所述酶 中的至少兩種或三種（或其一個或多個亞基）。
[0031] 在一個實施方案中，所述一種或多種外源性核酸是核酸構建體或載體，在一個具 體實施方案中是質粒，其編碼呈任何組合形式的上文提及的一種或多種酶。在一個實施方 案中，所述外源性核酸是表達質粒。
[0032] 在一個實施方案中，所述微生物包含被改造以用于增加親本微生物中存在的一種 或多種核酸的表達的一種或多種外源性核酸，以及被改造以用于表達親本微生物中不存在 的一種或多種酶的一種或多種外源性核酸。在另一個實施方案中，所述微生物包含被改造 以用于降低或基本上消除親本微生物中存在的酶的活性的一種或多種核酸。
[0033] 在一個具體實施方案中，親本微生物選自包含以下的一氧化碳營養(yǎng) 型產乙酸細菌：自產乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)、揚氏梭菌 (Clostridium Ijungdahlii)、拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭 菌（Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌（Clostridium drakei)、奠味梭菌 (Clostridium scatologenes)、乙酸梭菌（Clostridium aceticum)、甲酸乙酸梭菌 (Clostridium formicoaceticum)、大梭菌（Clostridium magnum)、甲基營養(yǎng)丁酸桿 菌（Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏乙酸桿菌（Acetobacterium woodii)、 巴氏嗜喊菌（Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、派泥真桿菌（Eubacterium Iimosum)、熱醋穆爾氏菌（Moorella thermoacetica)、熱自養(yǎng)穆爾氏菌（Moorella thermautotrophica)、卵形鼠抱菌（Sporomusa ovata)、Sporomusa silvacetica、類球鼠抱 菌（Sporomusa sphaeroides)、普氏產醋酸桿菌（Oxobacter pfennigii)以及凱伍熱厭氧菌 (Thermoanaerobacter kiuvi)〇
[0034] 在一個實施方案中，所述親本微生物是自產乙醇梭菌或揚氏梭菌。在一個具體實 施方案中，所述微生物是自產乙醇梭菌DSM23693。在另一個具體實施方案中，所述微生物是 揚氏梭菌 DSM13528 (或 ATCC55383)。
[0035] 在一個實施方案中，所述親本微生物缺乏以下一種或多種酶的活性：
[0036] 催化（R)-乙偶姻轉化成（R，S) -2, 3- 丁二醇的酶；
[0037] 催化（R，S) -2, 3- 丁二醇轉化成MEK的酶；以及
[0038] 催化MEK轉化成2- 丁醇的酶。
[0039] 在一個實施方案中，所述親本微生物缺乏編碼以下一種或多種酶的一種或多種基 因：
[0040] 催化（R)-乙偶姻轉化成（R，S) -2, 3- 丁二醇的酶；
[0041] 催化（R，S) -2, 3- 丁二醇轉化成MEK的酶；以及
[0042] 催化MEK轉化成2- 丁醇的酶。
[0043] 在一個實施方案中，所述親本微生物缺乏編碼（S)-2, 3- 丁二醇脫氫酶、二醇/甘 油脫水酶和醇脫氫酶和/或其中任何一種或多種的功能上等效的變體的一種或多種基因。
[0044] 在一個實施方案中，所述親本微生物包含編碼（R)_2, 3-丁二醇脫氫酶、醇脫氫酶 和/或其任何一種或多種的功能上等效的變體的一種或多種基因。
[0045] 在一個實施方案中，所述親本微生物包含編碼（R)_2, 3-丁二醇脫氫酶、醇脫氫酶 或其任何一種或多種的功能上等效的變體的一種或多種基因，并且缺乏編碼（S)-2, 3-丁 二醇脫氫酶、二醇/甘油脫水酶和/或其任何一種或多種的功能上等效的變體的一種或多 種基因。
[0046] 在第二方面中，本發(fā)明提供編碼一種或多種酶（或其一個或多個亞基）的核酸，所 述一種或多種酶（或其一或多個亞基）當在微生物中表達時允許所述微生物通過發(fā)酵包含 CO的底物來產生MEK和/或2- 丁醇。
[0047] 在一個實施方案中，所述核酸編碼兩種或更多種酶（或其一個或多個亞基），所述 兩種或更多種酶（或其一個或多個亞基）當在微生物中表達時允許所述微生物通過發(fā)酵包 含CO的底物來產生MEK和/或2- 丁醇。
[0048] 在一個實施方案中，核酸編碼一種或多種選自如下的酶：
[0049] 催化（R)-乙偶姻轉化成（R，S) -2, 3- 丁二醇的酶；
[0050] 催化（R，S) -2, 3- 丁二醇轉化成MEK的酶；以及
[0051] 催化MEK轉化成2- 丁醇的酶。
[0052] 在一個實施方案中，所述酶是選自（S) -2, 3- 丁二醇脫氫酶、二醇/甘油脫水酶、醇 脫氫酶和/或其中任何一種或多種的功能上等效的變體。
[0053] 在一個實施方案中，所述核酸包含以任何次序編碼（S) -2, 3- 丁二醇脫氫酶、二醇 /甘油脫水酶和/或其中任何一種或多種的功能上等效的變體的核酸序列。
[0054] 在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸還包含啟動子。在一個實施方案中，所述啟動子 允許所述基因在其控制下的組成型表達。在一個具體實施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇 啟動子。在另一個具體實施方案中，使用磷酸轉乙酰酶/乙酸激酶操縱子啟動子。在一個 具體實施方案中，所述啟動子是來自自產乙醇梭菌。
[0055] 在另一方面中，本發(fā)明提供被改造以用于降低或消除親本微生物中（R)_2, 3-丁 二醇脫氫酶、醇脫氫酶和/或其中任何一種或多種的功能上等效的變體的表達的核酸。
[0056] 在另一方面中，本發(fā)明提供被改造以用于當存在于親本微生物中時增加 (S)_2, 3-丁二醇脫氫酶、二醇/甘油脫水酶、醇脫氫酶和/或其中任何一種或多種的功能上 等效的變體中一種或多種的表達的核酸。
[0057] 在第三方面中，本發(fā)明提供包含一種或多種第二方面的核酸的核酸構建體或載 體。
[0058] 在一個具體實施方案中，所述核酸構建體或載體是表達構建體或載體。在一個具 體實施方案中，所述表達構建體或載體是質粒。
[0059] 在第四方面中，本發(fā)明提供宿主生物，其包含第二方面的核酸或第三方面的載體 或構建體中的任何一種或多種。
[0060] 在第五方面中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含本發(fā)明的第三方面提及的表達構 建體或載體以及甲基化構建體或載體。
[0061] 優(yōu)選地，所述組合物能夠產生本發(fā)明的第一方面的重組微生物。
[0062] 在一個具體實施方案中，所述表達構建體/載體和/或甲基化構建體/載體是質 粒。
[0063] 在第六方面中，本發(fā)明提供一種用于通過微生物發(fā)酵來產生MEK和/或2- 丁醇和 任選的一種或多種其它產物的方法，所述方法包含使用本發(fā)明第一方面的重組微生物發(fā)酵 包含CO的底物。
[0064] 在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟：
[0065] (a)向含有本發(fā)明第一方面的一種或多種微生物的培養(yǎng)物的生物反應器提供包含 CO的底物；并且
[0066] (b)在所述生物反應器中厭氧發(fā)酵所述培養(yǎng)物以至少產生MEK和/或2- 丁醇。
[0067] 在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟：
[0068] a.在由于工業(yè)過程產生的含CO的氣體被釋放到大氣中之前捕獲所述氣體，
[0069] b.利用含有本發(fā)明的第一方面的一種或多種微生物的培養(yǎng)物厭氧發(fā)酵所述含CO 的氣體以至少產生MEK和/或2- 丁醇。
[0070] 在該方法方面的具體實施方案中，所述微生物被維持在水性培養(yǎng)基中。
[0071] 在該方法方面的具體實施方案中，所述底物的發(fā)酵在生物反應器中進行。
[0072] 優(yōu)選地，所述包含CO的底物是包含CO的氣態(tài)底物。在一個實施方案中，所述底物 包含工業(yè)廢氣。在某些實施方案中，所述氣體是鋼廠廢氣或合成氣。
[0073] 在一個實施方案中，所述底物通常將含有較大比例的C0,如至少約20體積％至約 100體積％ C0, 20體積％至70體積％ C0, 30體積％至60體積％ C0,以及40體積％至55 體積％ C0。在具體的實施方案中，所述底物包含約25體積％、或約30體積％、或約35體 積％、或約40體積％、或約45體積％、或約50體積％ C0,或約55體積％⑶，或約60體積％ CO0
[0074] 在某些實施方案中，所述方法還包括從發(fā)酵液中回收MEK和/或2- 丁醇和任選的 一種或多種其它產物的步驟。
[0075] 在第七方面中，本發(fā)明提供通過第六方面的方法產生時的MEK和/或2- 丁醇。
[0076] 在另一方面中，本發(fā)明提供一種用于產生本發(fā)明的第一方面的微生物的方法，其 包括用一種或多種外源性核酸轉化親本微生物使得所述微生物能夠通過發(fā)酵包含CO的底 物來產生MEK和/或2- 丁醇和任選的一種或多種其它產物，其中所述親本微生物不能通過 發(fā)酵包含CO的底物來產生MEK和/或2- 丁醇。
[0077] 在一個具體實施方案中，用被改造以用于表達親本微生物中不存在的MEK和/或 2-丁醇生物合成途徑中的一種或多種酶的一種或多種外源性核酸來轉化所述親本微生物。 在另一個實施方案中，用被改造以用于過表達親本微生物中存在的MEK和/或2- 丁醇生物 合成途徑中的一種或多種酶的一種或多種核酸來轉化所述親本微生物。在另一個實施方案 中，用一種或多種外源性核酸轉化親本微生物，所述一種或多種核酸被改造用于表達所述 親本微生物中不存在的MEK和/或2- 丁醇生物合成途徑中的一種或多種酶并且過表達所 述親本微生物中天然存在的MEK和/或2- 丁醇生物合成途徑中的一種或多種酶。在另一 個實施方案中，親本微生物被轉化以降低或基本上消除可將2- 丁酮轉化成2- 丁醇的一種 或多種酶和/或可將（R)-乙偶姻轉化成（R，R)-2, 3-丁二醇的一種或多種酶的活性。在一 個實施方案中，親本微生物被轉化以表達或過表達一種或多種酶并且降低或基本上消除一 種或多種其它酶的活性。
[0078] 在某些實施方案中，所述一種或多種酶是如的。
[0079] 在某些實施方案中，親本微生物是如上文所述的。
[0080] 提供了分離的遺傳工程改造的一氧化碳營養(yǎng)型產乙酸細菌，其包含編碼內消 旋-2, 3- 丁二醇脫氫酶的外源性核酸和編碼二醇/甘油脫水酶的外源性核酸。細菌從這些 核酸表達所述酶。所述兩種酶可以在同一細菌中表達或其可以分別存在于不同細菌中。一 般來說，所述細菌在天然狀態(tài)下不表達所述酶。在一些情況下，所述細菌在D-(_) 2, 3-丁二 醇脫氫酶基因中具有敲除突變。在其它情況下，所述細菌還可包含編碼二醇/甘油脫水酶 的再活化蛋白的外源性核酸。這些可延長脫水酶的活性壽命，所述脫水酶會在與其底物和 /或產物長期接觸之后失去活性。所述細菌通?？梢栽趨捬鯒l件下表達所述酶。
[0081] 在一些實施方案中，所述細菌還可在其醇脫氫酶基因中包含敲除突變。這可以減 少或防止所編碼的醇脫氫酶的表達。這種突變將減少或防止2- 丁醇的形成，導致MEK的積 聚。MEK可以是發(fā)酵的所需產物，因此這種突變可以是高度合乎需要的。在一些實施方案 中，所述細菌還可在其D-(-) 2, 3- 丁二醇脫氫酶中包含敲除突變。這將減少或防止MEK或 2_ 丁醇的產生所不需要的丁二醇異構體的形成。任選地，所述細菌還可包含編碼二醇/甘 油脫水酶的再活化蛋白的外源性核酸。這將有助于保持以所需水平從內消旋-2, 3-丁二醇 產生MEK。
[0082] 還提供了質粒，其可用于轉化本文所述的發(fā)酵和轉化過程中使用的一氧化碳營養(yǎng) 型產乙酸細菌。所述質?？梢栽谝谎趸紶I養(yǎng)型產乙酸細菌中復制，即其具有適合的復制 起點。在一些情況下，所述質粒將包含編碼內消旋-2, 3-丁二醇脫氫酶的核酸和編碼二醇/ 甘油脫水酶的核酸，但是任一者可以單獨存在于質粒中。當所述質粒被轉化到所述細菌中 時，合乎需要地是所述細菌表達所述酶?；蛘撸绻褂谜T導型啟動子用于表達，那么它們 可以僅在被誘導時表達。
[0083] 這類細菌和質?？捎糜趯嵤O和/或CO2轉化成2- 丁醇的方法。含CO和/ 或含CO2的氣態(tài)底物被傳送到含有上述一氧化碳營養(yǎng)型產乙酸細菌的培養(yǎng)物的生物反應器 中。在使得所述細菌能夠將CO和/或CO 2轉化成2- 丁醇的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細 菌?？梢砸赃B續(xù)或間斷（episodic)方式從所述生物反應器回收丁醇。
[0084] 一些上文所討論的細菌被很好地改造為適用于在將CO和/或CO2轉化成甲基乙 基酮（MEK)的方法中使用。如上文所討論的，所述細菌將合乎需要地具有降低或減少醇脫 氫酶的活性或產生的突變。在所述方法中，含CO和/或含CO 2的氣態(tài)底物被傳送到含有 適當的一氧化碳營養(yǎng)型產乙酸細菌的培養(yǎng)物的生物反應器中。在使得所述細菌將CO和/ 或CO 2轉化成MEK的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌?？梢允褂萌魏我阎椒ㄟB續(xù)地或間斷地 (saltitorily)從生物反應器中回收MEK。在一些情況下，所用的細菌將在D- (-) -2, 3- 丁二 醇脫氫酶基因中具有敲除突變以減少副產物的產生。在其它情況下，所述細菌還可包含編 碼二醇/甘油脫水酶的再活化蛋白的外源性核酸。這將使內消旋-2, 3- 丁二醇轉化為MEK 的步驟保持穩(wěn)健。在一些情況下，所述細菌將同時具有D-(-)-2, 3-丁二醇脫氫酶基因中的 敲除突變和編碼二醇/甘油脫水酶的再活化蛋白的外源性核酸。
[0085] 還提供可用于轉化在所選細菌中并在其中表達的核酸。一種可用的核酸編碼針 對自產乙醇梭菌進行密碼子優(yōu)化的內消旋-2, 3-丁二醇脫氫酶。另一可用的核酸編碼針 對自產乙醇梭菌進行密碼子優(yōu)化的二醇/甘油脫水酶。在一個具體實施方案中，所述內消 旋-2, 3-丁二醇脫氫酶是肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)內消旋-2, 3-丁二醇 脫氫酶。在另一個具體實施方案中，所述核酸編碼產酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca) 二醇/甘油脫水酶。在另一個具體實施方案中，所述核酸編碼產酸克雷伯氏菌二醇/甘油 脫水酶。這些各種編碼序列可以在一個或多個分子（如一個或多個質粒）上。如果欲使用 多個質粒，那么其復制起點將合乎需要地是相容的。還可在適當的噬菌體上攜帶所述核酸。 [0086] 本發(fā)明還可以在廣義上被說成單獨地或共同地包含在本申請的說明書中提及或 指示的部分、要素和特