r>[0248] 還需要的是，含CO的氣態(tài)底物的引入速率是例如使得確保液相中的CO濃度不會 變成限制性的。這是因為CO限制性條件的后果可能是一種或多種產(chǎn)物被培養(yǎng)物所消耗。
[0249] 用于進料發(fā)酵反應(yīng)的氣流的組成可對所述反應(yīng)的效率和/或成本具有顯著影響。 舉例來說，〇2可以降低厭氧發(fā)酵過程的效率。在發(fā)酵之前或之后對發(fā)酵過程各階段中非所 需或非必要的氣體的處理會增加這些階段的負擔(dān)（例如當在氣流進入生物反應(yīng)器之前將 其壓縮時，不必要的能量可能用于壓縮在發(fā)酵中非所需的氣體）。因此，可能需要處理底物 流，尤其是來源于工業(yè)來源的底物流，從而去除非所需組分并且增加所需組分的濃度。
[0250] 在某些實施方案中，本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)物被維持在水性培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，所 述水性培養(yǎng)基是基本厭氧微生物生長培養(yǎng)基。適合的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域中已知的，并且記載 于例如美國專利第5, 173, 429號和第5, 593, 886號和WO 02/08438中，并且如下文實施例 部分中所描述。
[0251] MEK和/或2- 丁醇或者含有MEK和/或2- 丁醇和/或一種或多種其它產(chǎn)物 的混合流可通過本領(lǐng)域中已知的方法（如分餾或蒸發(fā)、滲透蒸發(fā)、氣提和萃取發(fā)酵，包 括例如液-液萃?。陌l(fā)酵液中回收。又例如，用于萃取丁醇的方法記載于：KSpkc &Dilrre, 2011, Biochemical production of biobutanol, In:Handbook of biofuels production: processes and technologies(Eds. :Luque, Campelo&Clark), Woodhead Publishing Ltd, Camebridge, UK: 221 - 257 中。
[0252] 在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，MEK和/或2- 丁醇和一種或多種產(chǎn)物通過以下 方式從發(fā)酵液中回收：從生物反應(yīng)器中連續(xù)移出一部分發(fā)酵液，從發(fā)酵液中分離微生物細 胞（通過過濾方便地進行），并且從發(fā)酵液中回收一種或多種產(chǎn)物。醇可以例如通過蒸餾方 便地回收。丙酮可例如通過蒸餾回收。任何產(chǎn)生的酸可例如通過吸附于活性炭上來回收。 優(yōu)選地，將分離的微生物細胞送回到發(fā)酵生物反應(yīng)器中。已移出任何醇和酸之后剩余的無 細胞滲透物也優(yōu)選地被送回到發(fā)酵生物反應(yīng)器中。其它營養(yǎng)物（如B族維生素）可被加入 到所述無細胞滲透物中以補充所述營養(yǎng)物培養(yǎng)基，隨后將其送回到生物反應(yīng)器中。
[0253] 此外，如果如上文所述調(diào)整發(fā)酵液的pH以增強乙酸對活性炭的吸附，那么在被送 回至生物反應(yīng)器中之前，pH應(yīng)被重新調(diào)整到與發(fā)酵生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)液的pH類似的pH。
[0254] 實施例
[0255] 現(xiàn)將參考以下非限制性實例更詳細地描述本發(fā)明。
[0256] 微生物
[0257] 自產(chǎn)乙醇梭菌DSM10061和DSM23693 (DSM10061的衍生物）以及揚氏梭菌 DSM13528是獲自DSMZ(德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心，德國不倫瑞克市因霍芬 斯特拉斯 7B 38124(Inhoffenstra0e 7B，38124Braunschweig，Germany))。生長是在 37°C 下使用嚴格厭氧條件和技術(shù)（Hungate，1969，Methods in Microbiology，vol.3B. AcademicPress，New York: 117-132 ;Wolfe，1971，Adv. Microb. Physiol.，6:107-146)進行 的。使用化學(xué)成分確定的無酵母提取物的PETC培養(yǎng)基（表1)和30psi含有一氧化碳的鋼 廠廢氣（從位于新西蘭格倫布魯（Glenbr 〇〇k，NZ)的新西蘭鋼廠收集；組成：44% C0、32% N2、22% C02、2% H2)作為唯一的碳源和能量來源。
[0258] 表3 :PETC培養(yǎng)基
[0259]

[0264] 分析代謝物
[0265] 為了去除蛋白質(zhì)和其它細胞殘余物，將400 μ 1樣品與100 μ I 2% (w/v)5-磺基水 楊酸混合，并且在14, 000 X g下離心3分鐘以分離沉淀的殘余物。接著將10 μ 1上清液注射 到HPLC中以便進行分析。2, 3- 丁二醇、2- 丁醇和其它代謝物的HPLC分析是使用配備有在 35°C下操作的RID (折光率檢測器）和保持在35°C下的Aminex ΗΡΧ-87Η柱（300X7. 8mm， 粒徑9 μ m)的Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)進行。將略微酸化的水（0.005M H2SO4)用作流 速為0. 6ml/min的流動相。為了區(qū)分2, 3-丁二醇立體異構(gòu)體，使用配備有在35°C下操作 的RID (折光率檢測器）和保持在60°C下的Alltech I0A-2000有機酸柱（150X6. 5mm，粒 徑8 μπι)的Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)進行HPLC分析。將略微酸化的水（0.005M H2SO4) 用作流速為〇. 25ml/min的流動相。
[0266] 在自產(chǎn)乙醇梭菌中利用醇脫氫酶將MEK轉(zhuǎn)化成2-丁醇
[0267] 在一氧化碳營養(yǎng)型自產(chǎn)乙醇梭菌的基因組中鑒別出能夠?qū)EK轉(zhuǎn)化成2- 丁醇的 醇脫氫酶（Adh ;EC I. I. I. 2)(記載在PCT/NZ2012/000022中）。該酶與記載的將MEK轉(zhuǎn)化 成2-丁醇的來自拜氏梭菌（C.beijerinckii)的醇脫氫酶具有同源性（181]^;[16七31.，工 Bacteriol, 1993, 175:5079-5105)。
[0268] 為了證實這種活性，在具有PETC培養(yǎng)基（表1)和作為唯一的碳源和能量來源的 鋼廠廢氣（從位于新西蘭格倫布魯?shù)男挛魈m鋼廠收集；組成：44%C0、32%N 2、22%C02、2% H2)的50mL血清瓶中對一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌和拉氏梭菌進行 生長實驗。在對數(shù)生長期間，將5g/L MEK加入到所述培養(yǎng)物中。在生長結(jié)束時，無 MEK剩余， 但檢測到等量的 2-丁醇（表4)。根據(jù) Ismail et al. (J. Bacteriol, 1993, 175:5079-5105) 使用自產(chǎn)乙醇梭菌的粗提取物進行酶測定，并且可使用MEK作為底物以及NADPH作為輔因 子成功地檢測到活性。
[0269] 表4 :通過一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌、拉氏梭菌將MEK轉(zhuǎn) 化成2- 丁醇
[0271] 作為活性的進一步證明，將所述醇脫氫酶基因克隆到表達載體中，在大腸桿菌中 過度產(chǎn)生并且測量將MEK轉(zhuǎn)化成2- 丁醇的活性。
[0272] 從基因組DNA中擴增所述基因并且經(jīng)由KpnI和HindIII使用以下方案將其克隆 到pBAD載體中。使用KpnI-HF和HindIII以類似方法消化擴增的ADH基因并且將其通過 電穿孔將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MC1061細胞中。通過DNA測序來驗證ADH基因的序列。將轉(zhuǎn) 化的細胞在37°C下培養(yǎng)在具有氨芐青霉素的IOOmL LB中，直到0D_達到0. 8。此時，加入 ImL 20%阿拉伯糖，并且將所得培養(yǎng)物在28°C下孵育以便進行其余的表達。將細胞沉淀， 并且倒出上清液。接著再將沉淀重懸在HEPES緩沖液（50mM Na-HEPES和0.2mM DTT，pH 8· 0)中，加入各自 0· 2 μ L 的 Benzonase (Merck，25 單位 / 微升）和 rLysozyme (Merck，30kU/ uU。接著經(jīng)由融合的N端His6tag使用固定化金屬親和色譜純化醇脫氫酶。將細胞在冰 上孵育30分鐘后，通過超聲處理來裂解細胞，將不溶性碎片沉淀，并且使用0. 2微米過濾器 使上清液澄清。將澄清的上清液加入到已用裂解緩沖液徹底洗滌的Talon樹脂（Clontech) 中。500 μ L床體積用于純化，并且允許蛋白質(zhì)在4°C下結(jié)合于Talon樹脂一小時，并且接 著用裂解緩沖液洗滌數(shù)次。使用補充有150mM咪唑的裂解緩沖液從所述柱洗脫蛋白質(zhì)，并 且將洗脫物收集在500 μ L洗脫份中。將整個純化過程的各個階段獲取的等分試樣以及所 有洗脫級分在SDS PAGE凝膠上進行電泳，以證實蛋白質(zhì)的存在并且確定純化成功。使用 Amicon Ultra-4離心過濾器裝置（Millipore)將蛋白質(zhì)交換到儲存緩沖液（50mM磷酸鉀、 150mM NaCl、10%v/v甘油，pH 7.0)中。蛋白質(zhì)當在大腸桿菌中表達時是高度可溶的，并 且可易于純化。使用濃度為0. 2mM的NADPH作為輔因子以及3mM MEK作為底物在具有石英 杯的UV/vis分光光度計中進行活性測定。所述測定混合物含有50mM Tris-HCl緩沖液（pH 7. 5)，具有ImM DTT。醇脫氫酶在以MEK作為底物的情況下展示出活性，KeatSAAiZsec-1, 1^為 1·2±0· ImM，并且所得 Kcat/Ks^S.SXK^sec^nT1。
[0273] 使用來自產(chǎn)酸克雷伯氏菌的二醇脫水酶基因（pddABC)構(gòu)建梭菌表達質(zhì)粒
[0274] 使用標準重組DNA和分子克隆技術(shù)[Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989 ；Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD,Seidman JG, Smith JA, Struhl K:Current protocols in molecular biology. John ffiley&Sons, Ltd. , Hoboken, 1987]〇
[0275] 使用引物 Ppta-ack-NotI-F(SEQ ID N0:2 :GAGCGGCCGCAATATGATATTTATGTCC) 和 Ppta-ack-NdeI-R(SEQ ID N0:3:TTCCATATGTTTCATGTTCATTTCCTCC)從自產(chǎn)乙醇梭菌 DSM10061的基因組DNA中擴增磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶-乙酸激酶操縱子的啟動子區(qū)（Ppta-ack) (SEQ ID N0:1)，并且使用NotI和NdeI限制位點將其克隆到大腸桿菌-梭菌穿梭 載體 pMTL83151(FJ797647.1;Nigel Minton, University of Nottingham, UK) [Heap JT, Pennington OJ, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78:79-85]中，產(chǎn)生質(zhì)粒 pMTL83155。
[0276] 使用經(jīng)修改的Bertram and Dilrre (1989)的方法分離來自自產(chǎn)乙醇梭菌DSM 10061的基因組0嫩。將1001111過夜培養(yǎng)物收集（6,000\8，15分鐘，4°〇，用磷酸鉀緩沖 液洗滌（10mM，pH 7. 5)并且懸浮于 1.9ml STE 緩沖液（50mM Tris-HCl，lmM EDTA，200mM 蔗 糖；pH 8. 0)中。加入300 μ 1溶菌酶（約100, 000U)，并且將所得混合物在37°C下孵育30 分鐘，接著加入280 μ 1 10 % (w/v) SDS溶液并且再孵育10分鐘。通過加入240 μ I EDTA溶 液（0· 5Μ，pH 8)、20 μ I Tris-HCl (1Μ，pH 7. 5)和 10 μ I RNase A(Fermentas)來在室溫下 消化RNA。接著，加入100μΙ蛋白酶K(0.5U)，并且在37°C下進行蛋白水解1-3小時。最 后，加入600 μ 1高氯酸鈉（5M)，接著進行酚-氯仿萃取以及異丙醇沉淀。以分光光度法檢 查DNA數(shù)量和質(zhì)量。
[0277] 將編碼來自產(chǎn)酸克雷伯氏菌的二醇脫水酶（EC 4. 2. 1. 28,登錄號D45071)的基因 pddABC，所述基因 pddABC合成在針對自產(chǎn)乙醇梭菌進行密碼子優(yōu)化的單一操縱子（SEQ ID NO: 4)中，側(cè)翼為NdeI和EcoRI限制位點用于進行進一步亞克隆。接著使用限制性酶NdeI 和EcoRI將pddABC操縱子由pUC57載體亞克隆到pMTL83155中。
[0278] 將pddABC表達質(zhì)粒引入到自產(chǎn)乙醇梭菌中
[0279] 使用上述方法將質(zhì)粒pMTL83155_pddABC用于轉(zhuǎn)化自產(chǎn)乙醇梭菌。在含有15 μ g ml/1甲砜霉素（thiamphenicol)的YTF-瓊脂（8g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、2g/L NaCl、 2. 5g/L果糖以及7. 5g/L瓊脂，pH 5· 8)上進行外生長（outgrowth)，并且在37°C下在30psi 真正廠氣（Real Mill Gas)中孵育。將單菌落重新劃線在含有15 μ g ml/1甲砜霉素的 PETC-MES-瓊脂（表1，以MES代替碳酸鹽緩沖液且無果糖）上，接著重新劃線在含有15 μ g ml/1甲砜霉素和0. 5%果糖的PETC-MES-瓊脂上。從具有果糖的板中挑取多個克隆，并且在 具有30psi真正廠氣的鮑爾奇管（Balch tube)中在3mL具有0. 5%果糖的PETC-MES中生 長。通過PCR驗證質(zhì)粒的存在。
[0280] 測試自產(chǎn)乙醇梭菌中二醇脫水酶的體內(nèi)活性
[0281] 將攜帶pMTL83155_pddABC的自產(chǎn)乙醇梭菌菌株在存在內(nèi)消旋-2, 3- 丁二醇的情 況下生長并且與作為對照的野生型相比。當生長培養(yǎng)基補充有5g Γ1內(nèi)消旋-2, 3-丁二醇 時，在生長92小時之后，在轉(zhuǎn)化的菌株的培養(yǎng)物中檢測到12mg 1^2-丁醇，而在野生型中未 檢測到（表5)。在不受理論束縛下，本發(fā)明人相信二醇脫水酶將內(nèi)消旋-23BD0轉(zhuǎn)化成MEK， 而如上文所述自產(chǎn)乙醇梭菌中存在的醇脫氫酶活性接著將MEK轉(zhuǎn)化成2- 丁醇。
[0282] 表5 :在存在和不存在內(nèi)消旋-2, 3- 丁二醇的情況下來自表達和不表達pddABC基 因的自產(chǎn)乙醇梭菌的關(guān)鍵代謝物。數(shù)值代表三次重復(fù)的平均值加上或減去一個標準偏差。
[0284] 通過再活化蛋白ddrAB的共表達改進內(nèi)消旋-BDO到MEK的轉(zhuǎn)化
[0285] 二醇脫水酶PddABC酶復(fù)合體與2, 3-丁二醇的反應(yīng)，在引起產(chǎn)物形成的同時也 可引起所述酶復(fù)合體的失活（Bachovin et al, 1977)。在天然生物例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌 中，存在能夠再活化被破壞的酶復(fù)合體的其它酶（Mori K et al，1997)。為了提高內(nèi)消 旋-2, 3- 丁二醇到MEK的轉(zhuǎn)化效率，使適當?shù)脑倩罨鞍祝╕P_005016278和）與二醇脫水 酶基因共表達。合成針對自產(chǎn)乙醇梭菌而進行密碼子優(yōu)化的來自產(chǎn)酸克雷伯氏菌的再活化 蛋白基因 （GeneID :11660428和）ddrAB (SEQ ID NO: 6)，其側(cè)接限制性位點 SacI 和 KpnI。 用限制性酶SacI和KpnI將ddrAB操縱子克隆到pMTL83155-pddABC中。所產(chǎn)生的載體 pMTL83155-pddABC-ddrAB用于如上文所述轉(zhuǎn)化自產(chǎn)乙醇梭菌以改進內(nèi)消旋-2, 3- 丁二醇 到MEK和2- 丁醇的轉(zhuǎn)化。
[0286] 構(gòu)建具有用于產(chǎn)生內(nèi)消旋-2, 3-丁二醇的基因的表達質(zhì)粒以及在大腸桿菌中的 體內(nèi)測試
[0287] 對在自產(chǎn)乙醇梭菌中產(chǎn)生內(nèi)消旋-2, 3- 丁二醇的關(guān)注中，本發(fā)明人將來自肺炎克 雷伯氏菌的1^(1(：伍(：1.1.1.303，登錄號￥?_001335719)鑒別為能夠?qū)ⅸ柀?乙偶姻（其 作為中間體存在于自產(chǎn)乙醇梭菌中）轉(zhuǎn)化成內(nèi)消旋-2, 3-丁二醇。合成這種基因，并且 針對自產(chǎn)乙醇梭菌進行密碼子優(yōu)化（SEQ ID N0:5)并且將其接受在由Sail和XhoI限 制性位點側(cè)接的克隆載體PBSK中以便進一步亞克隆。從丙酮酸合成乙偶姻要求乙酰乳 酸合酶（ALS)和乙酰乳酸脫羧酶（ALDC)的連續(xù)作用，因此構(gòu)建了包含這兩種基因的質(zhì) 粒。首先，使用引物 Ppta-ack-NotI-F(SEQ ID N0:2 :GAGCGGCCGCAATATGATATTTATGTCC) 和 Ppta-ack-NdeI-R(SEQ ID N0:3 :TTCCATATGTTTCATGTTCATTTCCTCC)從自產(chǎn)醇梭菌 DSM10061的基因組DNA中擴增磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶-乙酸激酶操縱子的啟動子區(qū)（Ppta-ack) (SEQ ID NO: 1)，并且使用NotI和NdeI限制性位點將其克隆到大腸桿菌-梭菌穿梭 載體 pMTL85141(FJ797651.1;Nigel Minton, University of Nottingham, UK) [Heap JT, Pennington 0J, Cartman ST, Minton NP. A modular system for Clostridium shuttle plasmids. J Microbiol Methods. 2009, 78:79-85]中，產(chǎn)生質(zhì)粒 pMTL85145。在那之后， 使用引物 als-NdeI-F(SEQ ID N0:7 :GGAAGTTTCATATGAATAGAGATAT)和 als-EcoRl-R(SEQ ID NO: 8 :GGTATAGAATTCTGGTTTAATAGATAATGC)擴增來自自產(chǎn)乙醇梭菌的基因 als，并且 使用NdeI和EcoRl限制性位點將所得擴增子克隆到pMTL85145中。接著通過使用引物 ALDC-EcoRl-F(SEQ ID NO:9 :GCGAATTCGACATAGAGGTGAATGTAATATGG)和 ALDC-SacI-R(SEQ ID N0:10 :GCGAGCTCTTATTTTTCAACACTTGTTATCTCA)的擴增將 ALDC 加入到該質(zhì)粒中，并且接 著使用限制性位點EcoRl和SacI進行克隆，產(chǎn)生質(zhì)粒pMTL85145-ALS-ALDC。將budC基因 克隆到PMTL85145-ALS-ALDC中。將該構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化從大腸桿菌遺傳庫存中心（Genetic Coli Stock Centre，GCSC)獲得的大腸桿菌 JW1375_l(ldhA744(del)::kan)。所得菌株在 具有2%葡萄糖的M9培養(yǎng)基中厭氧生長，使用攜帶pMTL85145-ALS-ALDC-secAdh593的菌 株作為對照。對照菌株產(chǎn)生（D)-(-)-2, 3-丁二醇，并且無可檢測到的內(nèi)消旋-2, 3-丁二醇 (圖2)。攜帶具有budC的構(gòu)建體的菌株產(chǎn)生310mg L-I內(nèi)消旋-(R，S)-2, 3- 丁二醇和少 量（D) - (R, R) -2, 3- 丁二醇（圖 2)。
[0288] 從一氧化碳產(chǎn)生內(nèi)消旋-BDO
[0289] 自產(chǎn)乙醇梭菌DSM23693的D-(-)_2, 3- 丁二醇脫氫酶的失活：
[0290] 使用ClosTron II型內(nèi)含子介導(dǎo)的基因破壞工具將在自產(chǎn)乙醇梭菌DSM23693中 參與產(chǎn)生 D-(-)-2, 3-BD0 的 2, 3-丁二醇脫氫酶（2, 3-bdh)基因失活（Heap et al.，2010)。 使用ClosTron. com提供的Perutka算法鑒別已合成并傳遞到pMTL007C_E5載體中 的2, 3-bdh基因的有義鏈上468與469位堿基之間的II型內(nèi)含子靶位點。最終載體 pMTL007C-E5-2,3bdh-468! 469s(SEQ ID勵：11)含有反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座作用活化的61'11^標記物 (Retro-transposition-Activated ermB Marker) (RAM)，其在插入到革 E 位點中之后賦予對 抗生素克拉霉素（Clarithromycin)的抗性。
[0291] 如上文所述將pMTL007C-E5-2, 3bdh-468 ! 469s質(zhì)粒引入到自產(chǎn)乙醇梭菌 DSM23693中。依次進行單克隆的劃線：首先在含有15 μ g/ml甲砜霉素的PETC-MES培養(yǎng)基 上，接著在具有含有5 μ g/ml克拉霉素的PETC-MES培養(yǎng)基的瓊脂板上。使用引物0g42f (SEQ ID NO: 12)和0g