在藍(lán)藻中生產(chǎn)1,3-丙二醇的制作方法
【專利說明】在藍(lán)藻中生產(chǎn)1,3-丙二醇
[0001] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0002] 本申請要求2012年10月18日提交的美國臨時專利申請序列號61/715, 371的權(quán) 益，其公開的內(nèi)容通過提述并入本文。
[0003] y步及序列表
[0004] 本申請包含序列表，其通過EFS-Web提交，于2013年10月11日生成，名稱為 "PropanedioHS-PCI^seqJist-STSS"，大小為 102KB。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及經(jīng)修飾以產(chǎn)生有用化學(xué)品如1，3-丙二醇的藍(lán)藻宿主細(xì)胞。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 藍(lán)藻/藍(lán)細(xì)菌（cyanobacteria)(也稱作"藍(lán)綠藻"）是小的、主要為水生的原 核細(xì)胞，其具有進行產(chǎn)氧光合作用，并從輸入的光、營養(yǎng)物質(zhì)和CO 2制造生物質(zhì)和有機化 合物的能力。藍(lán)藻能夠經(jīng)遺傳增強以產(chǎn)生有價值的產(chǎn)物，如生物燃料、藥物、營養(yǎng)食品 等。例如，已描述了用編碼特定酶的基因轉(zhuǎn)化藍(lán)藻聚球藻屬（Synechococcus)可產(chǎn)生用 于生物燃料生產(chǎn)的乙醇（授予Woods等的美國專利號6, 699, 696和6, 306, 639)。在例如 PCT/US2007/001071、PCT/EP2009/000892 和 PCT/EP2009/060526 中描述了藍(lán)藻集胞藻屬 (Synechocystis)的轉(zhuǎn)化。
[0008] 化合物1，3_丙二醇是一種粘稠、無色、可與水混溶的液體。1，3_丙二醇可被用 作生產(chǎn)聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET)、尼龍、和PET變異體聚對苯二甲酸丙二醇酯（PTT) 的構(gòu)建塊（building block)。1,3-丙二醇也可用于多種材料中，包括粘合劑、層壓板 (laminates)、服裝（clothing)、地毯、塑料、涂料、模制品（moldings)、防凍劑、脂肪族聚醋 和共聚酯。
[0009] 1，3-丙二醇可以合成產(chǎn)生或者通過發(fā)酵產(chǎn)生。已經(jīng)有多種不同的1，3-丙二醇合 成制造方法被采用。例如，1，3-丙二醇可由下述合成產(chǎn)生：1)在膦、水、一氧化碳、氫和酸的 存在下，由環(huán)氧乙烷在催化劑上產(chǎn)生；2)通過丙烯醛的催化溶液相水合隨后進行還原；或 3)在一氧化碳和氫的存在下，由碳?xì)浠衔铮ㄈ绺视停┰诰哂衼碜灾芷诒淼赩III族的原子 的催化劑上反應(yīng)產(chǎn)生。
[0010] 美國專利號5, 786, 524教導(dǎo)了從環(huán)氧乙烷制備1，3-丙二醇。該過程涉及（1)鈷 催化環(huán)氧乙烷加氫甲?；ㄅc合成氣、H2/C0反應(yīng)）以制備中間產(chǎn)物3-羥基丙醛（HPA)的 稀釋溶液；（2)將HPA提取到水中形成更濃縮的HPA溶液；和（3)將HPA氫化為丙二醇。 [0011] 美國專利申請公開號20110125118描述了從丙烯酸合成生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法 的一個預(yù)示實例（prophetic example)。該方法包括在無支持物的（unsupported)釕催化 劑的存在下，使用攪拌反應(yīng)罐在1000 psi和150°C使3-羥基丙酸在液相（水和環(huán)己烷）中 加氫。
[0012] 在例如美國專利號5, 686, 276、美國專利號6, 358, 716和美國專利號6, 136, 576中 描述了使用重組工程化細(xì)菌通過糖和甘油發(fā)酵而生物法產(chǎn)生1，3-丙二醇。
[0013] 美國專利號8,216,816描述了可用于在微生物中產(chǎn)生1，3-丙二醇的生物 工程方法的預(yù)示性實例。預(yù)示方法利用如下的生物學(xué)途徑：酶sn-甘油-3-P脫氫酶 darl(ECl. I. 1 ;釀酒酵母（S. cerevisiae)來源）從二羥基丙酮-P、NADH和NADPH產(chǎn)生 sn-甘油-3-P。酶sn-甘油-3-磷酸酶gpp2(EC 3. 1. 3. 21 ;釀酒酵母來源）從sn-甘油-3-P 產(chǎn)生甘油。酶甘油脫水酶dhaBl-3 (EC 4. 2. 1. 30 ;肺炎克雷伯氏菌（K. pneumonia)來源）從 甘油產(chǎn)生3-羥基丙醛。酶1，3-丙二醇氧化還原酶dhaT (EC I. I. 1. 202 ;肺炎克雷伯氏菌 來源）將3-羥基丙醛和NADH轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇。
[0014] 目前生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法需要輸入有機碳源，如石化燃料（fossil fuel)或 糖。本發(fā)明的一個目的是從CO2作為輸入碳源，而不是從石化燃料或從其它有機起始原料 生產(chǎn)這些化合物的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 在本發(fā)明的一個方面中，提供了用于在藍(lán)藻中生產(chǎn)1，3-丙二醇的遺傳增強的核 酸序列，其具有至少一個能夠在藍(lán)藻中調(diào)芐基因表達(dá)的啟動子，和DAR1、GPP2、dhaBl-3、 orfZ、orf2b和yqhD基因。所述核酸序列能夠在藍(lán)藻細(xì)胞中復(fù)制。至少一個基因可存在于 質(zhì)粒上，例如外源的或內(nèi)源的質(zhì)粒，或者它可存在于藍(lán)藻染色體上。啟動子可為例如Psrp、 PnblA712(l、PrbcL_、PsmtA7cici2、和 ZiaR-PziaA68tl3。在一個實施方案中，啟動子序列可為，例 如，SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:4 或 SEQ ID N0:5。
[0016] 編碼DARl的基因可與SEQ ID N0:6具有至少98%的同一性。DARl多肽可與SEQ ID N0:7具有至少98%的同一性。編碼GPP2的基因可與SEQ ID N0:8具有例如至少98% 的同一性。GPP2多肽可與SEQ ID N0:9具有至少98%的同一性。dhaBl-3編碼核酸序列 可與SEQ ID NO: 10具有至少98%的同一性。dhaBl-3核酸序列能夠編碼三個分離的多肽， DhaBl、DhaB2和DhaB3,其中DhaBl多肽可與SEQ ID勵：12具有至少98%的同一性，01^82 多肽可與SEQ ID N0:14具有至少98%的同一性，而DhaB3多肽可與SEQ ID N0:16具有至少 98%的同一性。orfZ和orf2b核酸序列可與SEQ ID NO: 17具有至少98%的同一性。orfZ 基因可編碼與SEQ ID NO: 19具有至少98%的同一性的多肽，并且其中orf2b基因可編碼 與SEQ ID NO:21具有至少98%的同一性的多肽。yqhD基因可與SEQ ID NO:22具有至少 98%的同一性。YqhD多肽可與SEQ ID N0:23具有至少>98%的同一性。
[0017] 在本發(fā)明的另一個方面中，提供了遺傳增強的藍(lán)藻細(xì)胞，其具有DARl基因、GPP2 基因、dhaBl-3的核酸序列、orfZ基因、orf2b基因和yqhD基因，其中該細(xì)胞可產(chǎn)生1，3-丙 二醇。所述藍(lán)藻可為例如集胞藻屬菌種PCC6803或聚球藻屬菌種PCC 7002。
[0018] 在本發(fā)明的另一個方面中，提供了一種在藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生1，3-丙二醇的方法， 其通過向藍(lán)藻細(xì)胞引入核酸序列，其具有編碼DARl酶的基因、編碼GPP2酶的基因、編碼 DhaBl-3酶的基因、編碼OrfZ酶的基因、編碼0rf2b酶的基因和編碼YqhD酶的基因；然后 在產(chǎn)生1，3-丙二醇的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
[0019] 附圖簡沐
[0020] 圖1是用于從中心碳代謝物磷酸甘油酮（DHAP)生產(chǎn)1，3-丙二醇的生物合成途徑 的圖。當(dāng)將這個途徑中的基因轉(zhuǎn)移到藍(lán)藻時，這些代謝物能夠通過光合成和糖異生途徑使 用CO 2為輸入碳源來產(chǎn)生。
[0021] 圖2是廣宿主范圍RSF1010來源的質(zhì)粒PSL1211中的基因和相關(guān)特征的線性圖， 該質(zhì)粒用作本文所述表達(dá)載體的基礎(chǔ)。指示了相關(guān)的限制位點和終止子區(qū)（TT)。
[0022] 圖3是pSL1211來源質(zhì)粒（〃pABb〃）的線性化圖，其用作插入實施例4中所述丙二 醇基因的框架質(zhì)粒。指示了啟動子、終止子（TT)、和核糖體結(jié)合位點（RBS)。
[0023] 圖4是含有如實施例4所述的參與1，3-丙二醇產(chǎn)生的基因編碼區(qū)的核酸區(qū)段的 線性化圖。
[0024] 圖5是色譜跡線的重疊 （overlay of chromatograph trace)，其確認(rèn)1，3_丙二醇 途徑的起始部分的基因表達(dá)和從磷酸甘油酮成功轉(zhuǎn)化為甘油。跡線顯示攜帶質(zhì)粒ρΑΒΙΟΟΙ 的集胞藻屬菌種PCC 6803能夠產(chǎn)生中間產(chǎn)物甘油。還顯示了集胞藻屬菌種PCC 6803野生 型和100 μ M甘油標(biāo)準(zhǔn)物。跡線是在Dionex系統(tǒng)上使用液相色譜分離甘油產(chǎn)生的。將保 留時間為8. 1分鐘的峰鑒定為甘油。
[0025] 圖6是來自攜帶質(zhì)粒ρΑΒ1003的聚球藻屬菌種PCC 7002的5Χ濃縮的甲醇/磷酸 鹽提取物的圖片。跡線是使用氣相色譜分離1，3-丙二醇產(chǎn)生的。峰用質(zhì)譜鑒定。將保留 時間為5. 88分鐘的峰鑒定為1，3-丙二醇。該峰不存在于野生型聚球藻屬菌種PCC 7002 中。
[0026] 發(fā)明詳沐
[0027] 藍(lán)藻宿主細(xì)胞被遺傳增強以產(chǎn)生各種有價值的化學(xué)產(chǎn)物，例如1，3-丙二醇。在一 個實施方案中，參與1，3-丙二醇生物合成途徑的基因可被轉(zhuǎn)移到藍(lán)藻宿主細(xì)胞中。插入的 異源基因可存在于染色體外的質(zhì)粒上，或者它們可存在于藍(lán)藻染色體上。然后，藍(lán)藻按照一 般的藍(lán)藻方法進行培養(yǎng)，并在適當(dāng)?shù)臅r候移出丙二醇。在藍(lán)藻中而不是通過使用化學(xué)手段 生產(chǎn)1，3-丙二醇，允許以二氧化碳作為初始碳源而不是從原油或其它有機碳源生產(chǎn)該化 合物。
[0028] 本發(fā)明的方面利用分子生物學(xué)、微生物學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域常用的技術(shù)和方法。關(guān) 于這些類型的方法的有用實驗室參考對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是容易獲得的。參見，例如 Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第三版），Sambrook, J 等（2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Current Protocols in Microbiology(2007)Coico, R 等 編，John Wiley and Sons,Inc. ；The Molecular Biology of Cyanobacteria(1994)Donald Bryant (編），Springer Netherlands ；Handbook Of Microalgal Culture Biotechnology And Applied Phycology(2003)Richmond，A.;(編），Blackwell Publishing;和"The cyanobacteria, molecular Biology, Genomics and Evolution"，Antonia Herrero 和 Enrique Flores編，Caister Academic Press, Norfolk, UK, 2008。
[0029] 在本說明書中提到的全部出版物和專利申請通過提述并入本文，其程度如同每個 的出版物和專利申請被具體而個別地指示以通過提述并入。
[0030] 定義
[0031] 除非另外限定，否則本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù) 人員所公知的含義。如本文所使用的，除非另外指出，否則下列術(shù)語具有歸因于它們的含 義。
[0032] 術(shù)語"大約"在本文中使用的意思是大約、在所述范圍內(nèi)、粗略地或周圍。當(dāng)術(shù)語 "大約"和數(shù)值/數(shù)值范圍聯(lián)合使用時，它通過延伸所提數(shù)值的上下邊界對所述數(shù)值/范圍 進行修飾。一般地，術(shù)語"大約"在本文中用于修飾數(shù)值高于或低于所述數(shù)值的20%的變 異。
[0033] 術(shù)語"藍(lán)藻"是指一群光合自養(yǎng)原核微生物，其能夠利用太陽能和固定二氧化碳。 藍(lán)藻也被稱作藍(lán)綠藻。
[0034] 術(shù)語"宿主細(xì)胞"和"重組宿主細(xì)胞"意在包括適合于代謝操縱的細(xì)胞，例如能夠并 入異源多核苷酸序列，例如可被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。該術(shù)語意圖包括最初被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的后代。在 特殊的實施方案中，所述細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如，藍(lán)藻細(xì)胞。術(shù)語重組宿主細(xì)胞意圖包括已 經(jīng)被選擇或工程化從而具有某些期望的性能、并且適合于用本發(fā)明的組合物和方法進一步 增強的細(xì)胞。
[0035] "表達(dá)感受態(tài)（Competent to express) "是指細(xì)胞提供充分的細(xì)胞環(huán)境以表達(dá)內(nèi) 源和/或外源多核苷酸。
[0036] 如本文所使用的，術(shù)語"遺傳增強"是指野生型細(xì)胞內(nèi)源基因的任何改變或者向野 生型細(xì)胞添加非內(nèi)源的遺傳密碼，例如導(dǎo)入異源基因。更具體地，這些改變可以通過使用重 組DNA技術(shù)或突變?nèi)藶橹圃臁８淖兛缮婕暗鞍拙幋a序列或非蛋白編碼序列，例如調(diào)節(jié)序列 如啟動子或增強子。
[0037] "多核苷酸"和"核酸"是指如下的聚合物，其包括通過磷酸二酯鍵連接的核苷酸單 元（核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、相關(guān)天然存在的結(jié)構(gòu)變體和其合成的非天然存在的類 似物），相關(guān)天然存在的結(jié)構(gòu)變體，和其合成的非天然存在的類似物。因此，該術(shù)語包括如下 的核苷酸聚合物，其中核苷酸和它們之間的連接鍵包括非天然存在的合成類似物。應(yīng)當(dāng)理 解，在語境需要時，當(dāng)核苷酸序列用DNA序列（即A，T，G，C)代表時，它也包括RNA序列（即 八，認(rèn)6,〇，其中〃礦 /代替〃1'〃。
[0038] 本發(fā)明的核