油磷酸。在一個實施方案中，DARl酶是酶分類EC#1. I. 1. 8 的成員。在一個實施方案中，DARl核苷酸序列是SEQ ID NO: 6并且DARl氨基酸序列是SEQ ID N0:7〇
[0112] 術(shù)語"甘油-3-磷酸"和"GPP2"（也稱作〃YER062C〃和〃H0R2〃）是指在酵母中生 物合成甘油必需的酶。在酵母中，該酶被發(fā)現(xiàn)參與對各種細胞脅迫的響應(yīng)，例如滲透壓脅迫 和氧化脅迫（Pahlman等，J Biol Chem. 276:3555-3563 ;2001)。該酶能夠催化從甘油磷酸 形成甘油。"GPP2基因"是指編碼促進從甘油磷酸產(chǎn)生甘油的酶的基因。在一個實施方案 中，GPP2由核酸登錄號#NM001178953. 1編碼，并且蛋白登錄號為#NP 010984. 1，來自釀酒 酵母。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供重組光合微生物，其包括至少一種異源DNA序列， 其編碼的至少一種多肽催化從底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，導致從甘油磷酸合成甘油。在一個實施 方案中，GPP2酶是酶分類EC#3. 1.3. 21的成員。在一個實施方案中，GPP2核苷酸序列是SEQ ID NO: 8,而GPP2氨基酸序列是SEQ ID NO: 9。
[0113] 術(shù)語"輔酶B12依賴的甘油脫水酶"是指一組3個基因，統(tǒng)稱為〃dhaBl-3〃，其編碼 參與甘油脂代謝的酶復合體，該酶復合體能夠催化從甘油形成3-羥基丙醛。該酶復合體包 括三種多肽。在一個實施方案中，使用包含全部3個dhaB(dhaBl，dhaB2，dhaB3)核苷酸序 列的操縱子（SEQ ID NO: 10)。在一個實施方案中，dhaBl具有核酸序列SEQ ID NO: 11和氨 基酸序列SEQ ID NO: 12 ;dhaB2具有核酸序列SEQ ID NO: 13和氨基酸序列SEQ ID NO: 14; 和dhaB3具有核酸序列SEQ ID NO: 15和氨基酸序列SEQ ID NO: 16。
[0114] 總之，由dhaBl-3編碼的三種多肽形成的酶可促進從甘油產(chǎn)生3-羥基丙醛。在 一個實施方案中，該基因序列是核酸登錄號#CP000647. 1:3846008. . 3848700,蛋白登錄號 #ABR78884. 1、ABR78883. 1 和 ABR78882. 1，來自肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種（K. pneumoniae subspecies pneumonia) (Shroeter)Trevisan(ATCC#700721，本文稱作肺炎克雷伯氏菌 (K. pneumoniae)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供重組光合微生物，其包括至少一種異源 DNA序列，其編碼的至少一種多肽催化底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，導致從甘油合成羥基丙醛。在一 個實施方案中，dhaBl-3酶是酶分類EC#4. 2. 1. 30的成員。
[0115] 術(shù)語"orfZ"和"orf2b"是指甘油脫水酶再激活酶。在一個實施方案中，這些基因 來自肺炎克雷伯氏菌。在一個實施方案中，使用編碼orfZ和orf2b兩者的人工創(chuàng)建的操縱 子（SEQ ID NO: 17)。在一個實施方案中，orfZ的基因序列（SEQ ID NO: 18)是核酸登錄號 #CP000647. 1:3844172. 3845995,蛋白登錄號是 #ABR78881. 1("甘油脫水酶激活子";SEQ ID NO: 19)。這種酶具有分子伴侶樣活性，并具有從甘油脫水酶除去被破壞的輔酶M其已變 成無活性）的表觀功能。在一個實施方案中，〇rf2b的基因序列（"甘油脫水酶再激活因子 小亞基〃；SEQ ID N0:20)是 JF260927. 1:6577. · 6930,蛋白序列登錄號是#AEL12184. 1(SEQ ID N0:21)〇
[0116] 術(shù)語"yqhD"是指編碼醇脫氫酶的基因，該酶發(fā)揮1，3-丙二醇氧化還原酶的功能。 該酶能夠催化從3-羥基丙醛形成1，3-丙二醇。在一個實施方案中，該基因來自大腸桿菌。 在另一個實施方案中，該基因是核酸登錄號#NC_010473. 1:3251122. . 3252285,蛋白登錄號 是#￥? 001731875. 1。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供重組光合微生物，其包括至少一 種異源DNA序列，其編碼的至少一種多肽催化底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，導致從3-羥基丙醛合成 1，3-丙二醇。在一個實施方案中，YqhD酶是酶分類EC#1. 1.1. 202的成員。在一個實施方 案中，yqhD核苷酸序列是SEQ ID NO:22, yqhD氨基酸序列是SEQ ID NO:23。
[0117] 在藍藻中牛產(chǎn)甘油
[0118] 用于產(chǎn)生1，3-丙二醇的生物合成途徑的一部分參與甘油的產(chǎn)生，如下所示。前體 磷酸甘油酮通常在藍藻細胞中容易獲得。通過向藍藻細胞添加兩個基因 DARl和GPP2,就能 夠產(chǎn)生甘油，如實施例7和12所示。
[0119]
[0120] 向藍藻供給甘油以產(chǎn)牛1, 3-丙二醇
[0121] 某些藍藻物種含有甘油轉(zhuǎn)運蛋白，因此能夠從培養(yǎng)基獲取甘油。甘油目前一般可 作為生物柴油生產(chǎn)的廢物而獲得。因此，在一個實施方案中，具有內(nèi)源甘油轉(zhuǎn)運蛋白并進一 步具有至少一些如本文所述的1，3-丙二醇途徑基因（dhaBl-3、orf2B/orfZ和yqhD)的藍 藻物種能夠攝取外源添加的甘油以產(chǎn)生1，3-丙二醇產(chǎn)物。甘油供給可以是單次劑量，或者 能夠被間歇添加，或者能夠被恒定添加。在一個實施方案中，甘油在培養(yǎng)物的光/暗循環(huán)中 的黑暗期添加，以促進甘油攝取。
[0122] 藍藻細朐的轉(zhuǎn)化
[0123] 藍藻可以通過幾種合適的方法轉(zhuǎn)化。能夠用本文所述核酸進行轉(zhuǎn)化的示例性 藍藻包括，但不僅限于，集胞藻屬、聚球藻屬、Acaryochloris、魚腥藻屬（Anabaena)、嗜 熱聚球藻屬（Thermosynechococcus)、Chamaesiphon、色球藻屬（Chroococcus)、藍藻屬、 Cyanobium、Dactylococcopsis、Gloeobacter，粘球藻屬（Gloeocapsa)、Gloeothece、微抱 藻屬（Microcystis)、原綠球藻屬（Prochlorococcus)、Prochloron、Chroococcidiopsis、 Cyanocystis、Dermocarpella、Myxosarcina、Pleurocapsa、Stanieria、Xenococcus、節(jié)方定 藻屬（Arthrospira)、Borzia、Crinalium、Geitlerinema、Halospirulina、Leptolyngbya、 Limnothrix、革肖絲藻屬（Lyngbya)、Microcoleus、Cyanodictyon、Aphanocapsa、亶員藻 屬（Oscillatoria)、Planktothrix、Prochlorothrix、假魚腥藻屬（Pseudanabaena)、 螺方定藻屬（Spirulina)、Starria、Symploca、束毛藻屬（Trichodesmium)、Tychonema、 Anabaenopsis、束絲藻屬（Aphanizomenon)、Calothrix、Cyanospira、Cylindrospermopsis、 Cylindrospermum、節(jié)球藻屬（Nodularia)、念珠藻屬、Chlorogloeopsis、Fischerella、 Geitleria、Nostochopsis、Iyengariella、Stigonema、膠須藻屬（Rivularia)、偽枝藻屬 (Scytonema)、Tolypothrix、藍絲藻屬（Cyanothece)、席藻屬（Phormidium)、Adrianema 等 等。
[0124] 適合于轉(zhuǎn)化藍藻的示例性方法包括，作為非限制性實例，天然DNA攝?。–hung 等.（1998)FEMS Microbiol.Lett. 164:353-361 ;Frigaard 等.（2004)Methods Mol. Biol. 274:325-40 ;Zang 等.（2007) J. Microbiol. 45:241-245)，接合、轉(zhuǎn)導、玻璃微 球轉(zhuǎn)化（Kindle 等.（1989) J. Cell Biol. 109:2589-601 ;Feng 等.（2009)M〇1. Biol. Rep. 36:1433-9 ;美國專利號 5, 661，017)，碳化娃晶須轉(zhuǎn)化（Dunahay 等.（1997)Methods Mol. Biol. (1997)62:503-9)，生物射彈（Dawson 等.（1997)Curr. Microbiol. 35:356-62; Hallmann 等·（1997)Proc.Natl.Acad. USA 94:7469-7474 ;Jakobiak 等·（2004)Protist 155:381-93 ;Tan 等.（2005)J. Microbiol. 43:361-365 ;Steinbrenner 等.（2006)Appl Environ.Microbiol. 72:7477-7484 ;Kroth(2007)Methods Mol.Biol. 390:257-267 ;美 國專利號 5,661，017)，電穿孔（Kjaerulff 等.（1994)Photosynth. Res. 41:277-283 ; Iwai 等·（2004)Plant Cell Physiol.45:171_5;Ravindran 等·（2006)J.Microbiol. Methods 66:174-6 ;Sun 等· （2006)Gene 377:140-149 ;Wang 等· （2007)Appl.Microbiol. Biotechnol.76:651-657 ;Chaurasia 等·（2008)J. Microbiol. Methods 73:133-141; Ludwig 等.（2008) Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:729-35)，激光介導的轉(zhuǎn)化，或者 在任何聚（酰胺）樹狀物（Pasupathy 等·（2008)Biotechnol. J. 3:1078-82)、聚乙 二醇（Ohnuma 等.（2008)Plant Cell Physiol. 49:117-120)、陽離子脂質(zhì)（Muradawa 等.（2008) J. Biosci. Bioeng. 105:77-80)、右旋糖酐（dextran)、磷酸 鈣、或氯化鈣 (Mendez-Alvarez 等.（1994) J. Bacteriol. 176:7395-7397)的存在下或用其預處理之后 與DNA進行溫育，任選地在用細胞壁降解酶處理后與DNA溫育（Peirone等.（1998)Mol. Biol. Cell 9:3351-3365);和生物射彈方法（參見，例如 Ramesh 等.（2004)Methods Mol. Biol. 274:355-307 ;Doestch 等.（2001)Curr. Genet. 39:49-60 ;其內(nèi)容通過提述以其整體 并入本文）。
[0125] 培養(yǎng)藍藻細朐
[0126] 在一個實施方案中，1，3-丙二醇在藍藻培養(yǎng)物中合成，通過制備具有本文討論的 基因構(gòu)建體的宿主藍藻細胞并培養(yǎng)這些細胞。
[0127] 培養(yǎng)基的選擇取決于藍藻物種。在本發(fā)明的一個實施方案中，可使用如下的BG-Il 培養(yǎng)基生長藍藻（表1和表2,下文）。當生長鹽水物種時，可向培養(yǎng)基中添加 Instant Ocean (35g/L)和維生素 B12 (1 μ g/ml)。
[0128] 表1:示例培養(yǎng)基組成
[0132] 在一個實施方案中，細胞自營養(yǎng)生長，唯一的碳源是CO2。在另一個實施方案中，細 胞混合營養(yǎng)生長（mixotrophically)，例如添加碳源如甘油。
[0133] 培養(yǎng)物在室內(nèi)或室外生長。培養(yǎng)物可以是無菌或非無菌的。在另一個實施方案中， 培養(yǎng)物在無菌環(huán)境下在室內(nèi)生長，具有連續(xù)的光照。在另一個實施方案中，培養(yǎng)物在開放池 類型的光生物反應(yīng)器中室外生長。
[0134] 在一個實施方案中，藍藻在一個封閉的生物反應(yīng)器中生長，量為至少大約100升、 500升、1000升、2000升、5000升或更多。在一個實施方案中，藍藻細胞培養(yǎng)物在用透明塑 料材料制成的一次性柔韌的管狀光生物反應(yīng)器中生長。
[0135] 光周期可以根據(jù)期望設(shè)定，例如：連續(xù)光照，或者16小時開和8小時關(guān)，或者14小 時開和10小時關(guān)，或者12小時開和12小時關(guān)。
[0136] 從藍藻培養(yǎng)物分離和純化1, 3-丙二醇
[0137] 可以使用各種方法用于從藍藻培養(yǎng)基中除去1，3_丙二醇。關(guān)于數(shù)種當前使 用的用于分離和純化1,3-丙二醇的方法的評述參見，例如，Xiu等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:917-926 ;2008。
[0138] 在一個實施方案中，丙二醇在培養(yǎng)物生長期間從培養(yǎng)基中周期性分離。例如，將培 養(yǎng)基與細胞分離，隨后是過濾步驟。然后，可以從過濾物中除去丙二醇。如果需要，培養(yǎng)基 可以再次循環(huán)回到培養(yǎng)物，或者可以添加新的培養(yǎng)基。在另一個實施方