一株具有高膽酸鹽水解酶活性的嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株具有高膽酸鹽水解酶活性的嗜酸乳桿菌，以及該菌株在膽固醇去 除中的應(yīng)用，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著科技的進(jìn)步，人民膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，飲食營養(yǎng)越來越豐富，但隨之而來的 負(fù)面作用也越來越嚴(yán)重，尤其是冠心病、高血壓等心血管疾病的發(fā)病率不斷增長。人體血清 中膽固醇含量的升高被認(rèn)為是導(dǎo)致許多心血管疾病的重要因素。血清中膽固醇含量增加 1%，，患有高血壓等心血管疾病的概率會增加3%。大量國內(nèi)外研宄表明，血清中膽固醇含 量的高低直接影響到人類的健康，因此，抑制體內(nèi)膽固醇的合成、促進(jìn)膽固醇的分解代謝已 成為眾多專家學(xué)者的研宄課題。
[0003] 益生菌是一種對人體健康有益的活體微生物，它包括植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干 酪乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌等。他們能促進(jìn)乳糖消化， 增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)，對腸道致病菌產(chǎn)生拮抗作用，調(diào)節(jié)血脂，和降低膽固醇含量等功效，常被用 于乳品、肉品、水產(chǎn)品工業(yè)方面。近年來，大量研宄證明乳酸菌具有降低血清中膽固醇的功 效。Shimada等人發(fā)現(xiàn)在人體腸道中存在著許多細(xì)菌，他們可以降解結(jié)合膽鹽，從而促進(jìn)了 體內(nèi)膽固醇的分解代謝。因此，膽酸鹽水解酶走進(jìn)了人們的視野，對益生菌降膽固醇的作用 機(jī)理具有重要的意義。
[0004] BSH(膽鹽水解酶）是微生物生長代謝過程中產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物，主要由乳酸菌 產(chǎn)生，能將結(jié)合態(tài)甘氨酸膽鹽、?；撬崮扄}水解成游離膽酸和氨基酸殘基。BSH是一種胞內(nèi) 酶，屬于甘氨酸水解酶家族，N-端是半胱氨酸殘基，在氨基酸序列中的第一位半胱氨酸的巰 基是BSH分解的基礎(chǔ)，研宄表明，BSH中這個半胱氨酸殘基的位點(diǎn)是十分保守的。BSH可以 分別通過固醇類核團(tuán)和氨基酸集團(tuán)識別膽酸，因此具有底物特異性，導(dǎo)致不同種屬的菌水 解結(jié)合膽鹽的類型不同，能力也各不相同。
[0005] 乳酸菌中的膽酸鹽水解酶，除了具有降低血清中膽固醇的作用外，還能維護(hù)腸道 菌群平衡，抵抗膽鹽毒性，因此，篩選出具有高膽酸鹽水解酶活性的乳酸菌是非常必要的。 本發(fā)明篩選出的嗜酸乳桿菌具有較高的膽酸鹽水解酶活性，降膽固醇能力也很強(qiáng)，可廣泛 用于食品工業(yè)領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明通過茚三酮顯色法篩選出一株具有高膽酸鹽水解酶活性的嗜酸乳桿菌，命 名為KLDS1015,分類命名為嗜酸乳桿菌（Lactobacilus acidophilus)，該菌株是從傳統(tǒng)乳 制品中分離的乳酸菌中篩選出的，于2015年01月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，微生物保藏號為CGMCC No. 10436,保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所。
[0007] 本發(fā)明菌株 KLDS1015 的 16SrDNA 序列與 Lactobacilus acidophilus 序列相似性 達(dá)95%以上，根據(jù)16SrDNA序列分析，菌株KLDS1015被鑒定為嗜酸乳桿菌（Lactobacilus acidophilus)，其16SrDNA序列如核苷酸序列中SEQ ID N0:1所示，其以16SrDNA全序列為 基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。
[0008] 本發(fā)明的嗜酸乳桿菌（Lactobacilus acidophilus)KLDS1015具有較高的膽酸鹽 水解酶活力，其以?；敲撗跄懰猁}為底物下的比酶活可達(dá)到63. 71U/mg，同時(shí)該菌株具有較 高的降膽固醇的能力，其膽固醇去除率達(dá)到了 57. 9 %。
[0009] 因此，本發(fā)明進(jìn)一步地提供了嗜酸乳桿菌（Lactobacilus acidophilus)KLDS1015 在膽固醇去除中的應(yīng)用；及
[0010] 嗜酸乳桿菌（Lactobacilus acidophilus)KLDS1015在制備具有降血脂功能的發(fā) 酵乳制品中的應(yīng)用；及
[0011] 嗜酸乳桿菌（Lactobacilus acidophilus)KLDS1015在制備具有輔助降血脂功能 的活菌制劑中的應(yīng)用。
[0012] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述菌株單獨(dú)或與其他菌株混合發(fā)酵用于制備具有降血脂 功能的發(fā)酵乳制品。
[0013] 本發(fā)明篩選出的嗜酸乳桿菌KLDS1015具有較高的膽酸鹽水解酶活力和降膽固醇 的能力，為進(jìn)一步研宄嗜酸乳桿菌的降膽固醇機(jī)理和開發(fā)具有降膽固醇功能的乳酸菌制品 奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0014] 圖 1 為嗜酸乳桿菌（Lactobacilus acidophilus)KLDS1015 的系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0015] 圖2為牛磺酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0016] 圖3為蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0017] 圖4為膽固醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0019] 材料與試劑
[0020] 出發(fā)菌株：KLDS1. 1003和KLDS1015均分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)稀奶油或酸化奶油，由乳 品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心（KLDS-DICC)保藏，菌種使用前用MRS培養(yǎng)基活化 以上菌株，以1%接種量在37°C下培養(yǎng)15h，以備實(shí)驗(yàn)使用。
[0021] 培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基；高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基。
[0022] MRS培養(yǎng)基配制：蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，葡萄 糖20g/L，無水乙酸鈉5g/L，檸檬酸氫二胺2g/L，磷酸氫二鉀2g/L，硫酸鎂0. 58g/L，硫酸錳 〇.25g/L，吐溫-801ml/L，pH6.3±0. 1，121°C、15 分鐘滅菌；
[0023] 高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基配制：MRS液體培養(yǎng)基中添加0. 2%巰基乙酸鈉，0. 3%的 牛膽汁和l〇〇ug/ml的膽固醇。
[0024] 主要試劑：牛膽汁、?；敲撗跄懰徕c：Sigma公司；膽固醇：Amresco公司；鄰苯二 甲醛：中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；正己烷：分析純；巰基乙酸鈉：中國醫(yī)藥（集 團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司。
[0025] 主要儀器：JY92-2D超聲破碎粉碎機(jī)：SCIENTZ公司；厭氧箱Forma Anaerobic system 1029 :THERM0 ELECTRON CORPORATION 公司；DU800 型紫外分光光度計(jì)：BECKMAN COULTER ;GL-21M型低溫冷凍離心機(jī)：上海市離心機(jī)械研宄所。
[0026] 實(shí)施例1茚三酮顯色法篩選高產(chǎn)膽酸鹽水解酶活性的乳酸菌
[0027] (1)顯色液的配制
[0028] 茚三酮顯色液的配制：IOOmL茚三酮顯色液由0. 5g水和茚三酮、0. 3g果糖、6g磷 酸二氫鉀、IOg磷酸氫二鉀配制而成。
[0029] 蛋白質(zhì)顯色液：100mg考馬斯亮藍(lán)G250,50mL95%乙醇，100mL85%磷酸，用蒸餾水 混合定容到IL配制而成。
[0030] (2)膽酸鹽水解酶活力的定量檢測方法
[0031] 取IOmL在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)15h的乳酸菌培養(yǎng)液，在4°C、10000r/min離心10min， 菌體用0. lmol/L的磷酸緩沖溶液（pH7. 0)沖洗2次，再用ImLVc磷酸緩沖液（每毫升磷酸 緩沖液加 IOul IM Vc))懸浮，細(xì)菌懸浮液加入500ul 20m