g/ml的溶菌酶溶液，37°C水浴30 分鐘，再于冰浴中進行超聲波破碎15min(100W，15min，50%工作時間）。之后，4°C、10000r/ min離心10min。其上清液即為膽鹽水解酶液。0.1 mL的上清液中加入10. 8mL 0. lmol/L的 磷酸鈉緩沖溶液（PH6. 0)和0.1 mL的50mM的牛磺脫氧膽酸鹽溶液，這些混合物37°C溫浴 30min后冰浴，加入三氯乙酸（15%，w/v)，靜置3min終止酶反應，混合物離心后，在上清液 中加入I. 5mL的茚三酮顯色液，這些混合物漩渦震蕩后，煮沸15min。冷卻后測定其在570nm 處的吸光度值。標準曲線利用?；撬嶂谱?，?；撬釢舛鹊臉藴是€見圖2。
[0032] 蛋白質(zhì)濃度的測定采用牛血清白蛋白作為標準品。蛋白質(zhì)濃度的測定：稱量Ig牛 血清白蛋白，溶解并定容到1L，配成lg/L的標準溶液。稀釋成濃度為0、0.05、0. 1、0. 15、 0. 2、0. 25、0. 3、0. 35g/L，分別吸取300ul各濃度標準溶液和粗酶液至干凈試管，加入3ml蛋 白質(zhì)顯色液，充分混勻，常溫放置2min后迅速測量在595nm波長下的吸光度。蛋白質(zhì)濃度 的標準曲線見圖3。
[0033] 比酶活計算公式為：
[0034] 比酶活=[Aa(mM)] XV反應液體積（ml)/0.1 (ml) X30(min) X [protein(mg/ml)]·其 中，[Aa(mM)]比較標準曲線得到，(ml)為最終顯色液體積，30(min)為反應時間， [protein(mg/ml)]為蛋白質(zhì)濃度。
[0035] (3)定量檢測結果
[0036] 表1菌株在以?；敲撗跄懰猁}為底物下的比酶活
[0037]
[0038] 從表1可以看出，菌株KLDS1015的BSH比酶活很高。文獻中已知，嗜酸乳桿菌 La-XHl的比酶活為10. 71U/mg，嗜酸乳桿菌ATCC4356的BSH比酶活為I. 31U/mg，嗜酸乳桿 菌FTCC0291的BSH比酶活為I. 04U/mg，與之相比，本發(fā)明篩選出的嗜酸乳桿菌KLDS1015的 BSH活性很高，對牛磺脫氧膽酸鹽表現(xiàn)出了很高的膽酸鹽水解酶活性。
[0039] 實施例2乳酸菌菌株體外去除膽固醇的作用
[0040] (1)顯色劑的配制
[0041] 顯色劑的配制：顯色劑為鄰苯二甲醛溶液，稱取50mg鄰苯二甲醛，用冰乙酸溶解 并定容至l〇〇ml?，F(xiàn)用現(xiàn)配。
[0042] (2)乳酸菌菌株體外去除膽固醇能力的測定方法
[0043] 將活化好的乳酸菌菌株以2%接種量接種于高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培 養(yǎng)24h，同時保留未接菌的高膽固醇MRS液體培養(yǎng)基作為空白對照。分別測定上清液、菌體 洗滌液、菌體破碎液中膽固醇的含量。
[0044] 利用膽固醇標準溶液制作標準曲線，操作方法為：首先配制lOOug/ml的膽固醇標 準溶液，分別吸取0. 0ml、0. lml、0. 2ml、0. 3ml、0. 4ml、0. 5ml于IOml試管中，60°C氮吹揮發(fā) 盡溶劑，加入顯色劑2ml，濃硫酸Iml，混勻后在10-90分鐘內(nèi)測定550nm下的吸光值并繪制 標準曲線。膽固醇濃度的標準曲線見圖4。
[0045] 分別取菌體上清液、菌體洗滌液和菌體破碎液4ml加到干凈試管中，加33 % KOH溶 液3ml和95%乙醇3ml，充分混勻，于60°C水浴15min，待冷卻到室溫后加入3ml正己烷和 2ml蒸餾水，混勻，靜置20min后，取2ml正己烷層液體于干凈試管中，60°C氮吹揮發(fā)盡溶劑， 加入顯色劑2ml，濃硫酸lml，混勻后在10-90分鐘內(nèi)測定550nm下的吸光值。
[0046] 上清液：菌株在高膽固醇培養(yǎng)基中37 °C厭氧培養(yǎng)24h后，于4 °C、12, OOOg離心 IOmin的上清液；將傾出上清液的菌體細胞加入5. Oml 0. lmol/L pH7. 0磷酸鹽緩沖液，混 勻后于4°C、12, OOOg離心10min，取上清液即為菌體洗滌液；傾出菌體洗滌液，再加入5. Oml 0. lmol/L pH7. 0磷酸鹽緩沖液，置冰浴在細胞超聲波破碎儀破碎15min (100W，15min，50 % 工作時間）后，在4°C、12, OOOg離心10min，上清液即為菌體破碎液。其中上清液中的膽固 醇含量為未被乳酸菌去除的膽固醇；菌體洗滌液中的膽固醇是通過BSH去除的，菌體破碎 液中的膽固醇為菌體吸收的。
[0047] 乳酸菌對膽固醇的去除率=(C-C )/C
[0048] 式中：C為未接種乳酸菌的培養(yǎng)液離心上清液中膽固醇的實測濃度；
[0049] C為接種乳酸菌的培養(yǎng)液離心上清液中膽固醇的實測濃度。
[0050] (3)測定結果
[0051] 表2為乳酸菌體外去除膽固醇能力的測定結果（包括菌體吸收量和沉淀量）
[0052]
[0053] 從表2可以看出，菌株KLDS1015和菌株KLDS1. 1003這2株乳酸菌的膽固醇去除 能力都很強，都超過了 50%，其中KLDS1015膽固醇去除率高于KLDS1. 1003,兩株菌共沉淀 量都高于菌體吸收量。
[0054] 經(jīng)過以上篩選，最終確定菌株KLDS1015為以后的研宄菌株，此菌株具有較高 的膽酸鹽水解酶活力和較高的膽固醇去除率。經(jīng)過16SrDNA鑒定，它與Lactobacilus acidophilus核苷酸序列相似性達95%以上。根據(jù)16SrDNA序列分析，菌株KLDS1015被鑒 定為嗜酸乳桿菌，命名為KLDS1015,分類命名為嗜酸乳桿菌（Lactobacilus acidophilus)， 于2015年01月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，微生物保藏 號為CGMCC No. 10436,保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研 宄所；其16SrDNA序列如核苷酸序列中SEQ ID NO :1所示，其以16SrDNA全序列為基礎的系 統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所不。
【主權項】
1. 一株具有高膽酸鹽水解酶活性的嗜酸乳桿菌（Lactobacilusacidophilus)，命名為 KLDS1015,微生物保藏號為CGMCCNo. 10436,保藏日期為2015年01月26日，保藏單位為中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。2. 權利要求1所述的嗜酸乳桿菌在膽固醇去除中的應用。3. 權利要求1所述的嗜酸乳桿菌在制備具有降血脂功能的發(fā)酵乳制品中的應用。4. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的嗜酸乳桿菌單獨或與其他菌株混 合發(fā)酵用于制備具有降血脂功能的發(fā)酵乳制品。5. 權利要求1所述的嗜酸乳桿菌在制備具有輔助降血脂功能的活菌制劑中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株具有高膽酸鹽水解酶活性的嗜酸乳桿菌及其應用，所述的嗜酸乳桿菌命名為KLDS1015，分類命名為嗜酸乳桿菌(Lactobacilus acidophilus)，微生物保藏號為CGMCC No.10436。本發(fā)明篩選出的嗜酸乳桿菌具有較高的膽酸鹽水解酶活性，其降膽固醇能力也很強，可廣泛用于食品工業(yè)領域，為進一步研究嗜酸乳桿菌的降膽固醇機理和開發(fā)具有降膽固醇功能的乳酸菌制品奠定了基礎。CGMCC No.1043620150126
【IPC分類】C12N1/20, A23C9/127, A23C9/123, C12R1/23
【公開號】CN104928206
【申請?zhí)枴緾N201510212278
【發(fā)明人】霍貴成, 唐雅茹, 李春艷, 于上富
【申請人】東北農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年4月29日