分泌沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株、其單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫檢測及診斷領(lǐng)域，尤其涉及分泌沙門菌SpiC蛋白單抗的雜交瘤 細(xì)胞株、其分泌的單克隆抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] SpiC是第一個(gè)被鑒定出的由沙門氏菌毒力島2編碼的效應(yīng)蛋白，SpiC全長為127 個(gè)氨基酸，分子量約為14. 7kDa，推測其有雙重功能，與宿主蛋白TassC和Hook的相互作用， 預(yù)測了 SpiC在避免SCV與溶酶體融合機(jī)制中的重要作用，因?yàn)閮蓚€(gè)靶蛋白均為膜泡運(yùn)輸相 關(guān)蛋白。
[0003] SpiC的免疫學(xué)檢測是在特異性抗SpiC的單克隆抗體的基礎(chǔ)上建立的用于對樣本 中的SpiC進(jìn)行定性定量分析的實(shí)驗(yàn)方法。應(yīng)用不同的單抗標(biāo)記物和檢測技術(shù)，已經(jīng)開發(fā)出 多種方法，如酶免疫分析法（EIA)，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISP0T)， 流式細(xì)胞術(shù)（FCM)分析法等。
[0004] 競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assay，簡 稱競爭ELISA)技術(shù)具有高度的敏感性和應(yīng)用廣泛性，已成為近年來最吸引人的免疫檢測 方法之一，在疫苗的研發(fā)、臨床診斷以及基礎(chǔ)研宄等方面得到廣泛應(yīng)用。建立在免疫基礎(chǔ)上 的沙門菌檢測方法的靈敏度和特異性更高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種分泌沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該 雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，以及該雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單克隆抗體在免疫檢測 領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明的第一方面提供了一種分泌沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞 株，所述雜交瘤細(xì)胞株的保藏號為CCTCC NO :C201563。
[0008] 所述雜交瘤細(xì)胞株已于2015年4月26日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（地址：湖 北省武漢市武漢大學(xué)）注冊保藏，保藏號為CCTCC NO :C201563,分類命名為：雜交瘤細(xì)胞株 5F8〇
[0009] 本發(fā)明的第二方面提供了一種沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體，由保藏號為CCTCC NO :C201563的雜交瘤細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。
[0010] 本發(fā)明的第三方面提供了前述分泌沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株 及前述沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體在制備雞疫病的檢測試劑或診斷試劑中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明第四方面提供了一種沙門菌檢測試劑盒，所述試劑盒包括：
[0012] 1.選自以下任一：
[0013] 1)酶標(biāo)板和檢測原；
[0014] 2)包被有檢測原的酶標(biāo)板；
[0015] 所述檢測原是沙門菌SpiC蛋白。
[0016] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中采用的檢測原的制備方法詳見耿士忠，劉歡，焦新安 等.雞白痢沙門菌SpiC蛋白原核表達(dá)及其間接ELISA方法的建立[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué) 雜志，2015, 31(2) : 149-158。
[0017] 2. HRP標(biāo)記沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體；
[0018] 所述試劑盒中，酶標(biāo)板可以事先包被有檢測原，也可以只提供空白酶標(biāo)板與檢測 原，在檢測前由操作者自行采用常規(guī)方法在酶標(biāo)板上包被檢測原。
[0019] 所述酶標(biāo)板可為各種常見規(guī)格的酶標(biāo)板，如96孔酶標(biāo)板。
[0020] HRP標(biāo)記沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體的方法采用常規(guī)。
[0021] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述HRP標(biāo)記沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體中的沙門菌SpiC蛋白 單克隆抗體由保藏號為CCTCC NO :C201563的雜交瘤細(xì)胞株或其傳代細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。
[0022] 保藏號為CCTCC NO !C201563的雜交瘤細(xì)胞株已于2015年4月26日在中國典型 培養(yǎng)
[0023] 物保藏中心（地址：湖北省武漢市武漢大學(xué)）注冊保藏，分類命名為分類命名為： 雜
[0024] 交瘤細(xì)胞株5F8。
[0025] 進(jìn)一步的，所述試劑盒中還包括下列試劑中的一種或多種：
[0026] 1)底物液；
[0027] 2)洗滌液。
[0028] 上述試劑均為競爭ELISA檢測中的通用試劑，不受具體檢測項(xiàng)目的限制，因此即 可根據(jù)需要有選擇地加入試劑盒，也可由操作者自行配置或者單獨(dú)購買。為方便操作者，最 優(yōu)的選擇是試劑盒中，同時(shí)包括底物液和洗滌液。所述底物液可為競爭ELISA檢測試劑盒 中常用的通用底物液，如3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺（TMB)底物液。
[0029] 所述洗滌液可為競爭ELISA檢測試劑盒中常用的洗滌液，如磷酸鹽緩沖液等?？?以根據(jù)需要選用濃縮或未濃縮的洗滌液。
[0030] 進(jìn)一步的，所述試劑盒中還可以有選擇地包括其他競爭ELISA檢測所需通用試 劑，如封閉液、磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽吐溫緩沖液等。
[0031] 所述封閉液可為包被酶標(biāo)板常用的封閉液，如脫脂乳液、FBS、BSA或酪蛋白等。
[0032] 通常情況下，本發(fā)明的試劑盒中，各試劑分別隔離儲存。
[0033] 本發(fā)明進(jìn)一步基于上述SpiC蛋白競爭ELISA檢測試劑盒，建立了具有較好特異性 和靈敏度的沙門菌的競爭ELISA檢測方法，用于檢測雞血清，從而進(jìn)行機(jī)體免疫狀態(tài)評價(jià) 及疾病診斷方面的研宄。
[0034] 本發(fā)明的試劑盒可用于檢測感染沙門菌的雞血清樣品。
[0035] 利用本發(fā)明的試劑盒檢測感染沙門菌的雞血清樣品的檢測方法包括下列步驟：
[0036] 1、檢測原包被酶標(biāo)板；
[0037] 2、制備雞血清
[0038] 3、檢測
[0039] ①將檢測原用碳酸鹽緩沖液稀釋至最佳包被濃度，每孔IOOy L，輕輕混勻，4°C包 被過夜。棄去，？831'洗3次。每孔加入20(^1^1%834,37°〇反應(yīng)211，棄去，？831'洗3次。
[0040] ②在上述包被的酶標(biāo)板中加入最佳稀釋度的血清，每孔100 μ L，37°C孵育2h，
[0041] ③棄去樣品，PBST洗3次，加入HRP標(biāo)記沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體IOOL/孔， 37 0C
[0042] 孵育 Ih ;
[0043] ④棄去檢測抗體，PBST洗6次，加入TMB顯色液，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)5min ; [0044] ⑥加入2M H2SO4, 50 μ L/孔，使用酶標(biāo)儀于OD45tl波長下測定吸光值。
[0045] 上述方法通過離心分離雞血清，以陽性雞血清作為陽性樣品，以陰性雞血清作為 對照樣品，并以純化的保藏號為CCTCC NO !C201563的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗為檢測抗 體，結(jié)果顯示，該方法可以有效檢測出沙門菌。
[0046] 本發(fā)明的有益效果為：
[0047] 本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體具有效價(jià)高、特異性好、與天然抗原親 和力強(qiáng)的優(yōu)勢，基于此建立的檢測試劑盒，在檢測雞血清樣品時(shí)，具有較好的靈敏度和特異 性。采用本發(fā)明的試劑盒操作簡便，極大縮短了檢測時(shí)間，可以廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研宄，用 作雞機(jī)體免疫狀態(tài)的評價(jià)及感染性疾病診斷相關(guān)的研宄。
[0048] 本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞株保藏信息如下：
[0049] 雜交瘤細(xì)胞株名稱：雜交瘤細(xì)胞株5F8 ;
[0050] 保藏號為：CCTCC NO :C201563 ;
[0051] 保藏日期：2015年04月26日；
[0052] 保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；
[0053] 保藏單位簡稱：CCTCC ;
[0054] 保藏單位地址：中國.武漢.武漢大學(xué)。
【附圖說明】
[0055] 圖 I :5F8Western Blotting 鑒定圖，其中，1 為 rHis-SpiC 純化蛋白；2 為 BL21 (DE3) (pET) ;3 為 rGST-SpiC 純化蛋白；4 為 BL21 (pGEX-6p-l)。
【具體實(shí)施方式】
[0056] 以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí) 施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0057] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有