文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION， Third edition， Academic Press， San Diego,1998 ;METHODS IN ENZYMOLOGY， Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe,eds.) ,Academic Press，San Diego， 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol. 119, Chromatin Protocols(P.B. Becker， ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0058] 實施例1保藏號為CCTCC NO :C201563的雜交瘤細(xì)胞株的獲得
[0059] L動物免疫
[0060] 具體免疫程序如下：首次免疫，腹部皮下多點注射IOOyg經(jīng)弗氏完全佐劑充分乳 化的重組雞白痢沙門菌SpiC純化蛋白，2周后腹部皮下多點注射100 yg經(jīng)弗氏不完全佐劑 充分乳化的純化蛋白進行二次免疫，間隔2周后腹腔注射100 μ g不加佐劑的純化蛋白進行 第三次免疫，7天后眼眶采血測定血清抗體效價，選取效價較高的小鼠進行尾靜脈加強免疫 100 μ g不加佐劑的純化蛋白。
[0061] 2.細(xì)胞融合
[0062] 具體步驟如下：尾靜脈加強免疫3d后，采集少量血液，分離血清_20°C凍存，作為 篩選時的陽性對照。按生物安全方法處死免疫鼠，75%酒精浸泡消毒5min，無菌取脾細(xì)胞與 處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0在PEG(MW4000)作用下融合，用ICR小鼠腹腔巨噬細(xì) 胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，融合好的細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝96孔板，置37°C、6% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5d后加入新鮮HAT培養(yǎng)基，IOd后改用HT培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，定期觀察， 換液和檢測。
[0063] 3.間接ELISA檢測方法的建立
[0064] 采用間接ELISA方法篩選陽性細(xì)胞克隆。方陣試驗確定檢測抗原的包被濃度。
[0065] 檢測抗原用包被緩沖液橫向梯度稀釋，每孔100 μ 1包被ELISA板，4°C過夜；PBST 洗滌3次，每孔加入200 μ 1封閉液，4°C過夜；免疫鼠血清縱向倍比稀釋，每孔100 μ 1，正常 小鼠血清同樣倍數(shù)稀釋作為陰性對照，37°C孵育2h ;用PBST洗滌3次，加入工作濃度的酶 標(biāo)二抗，每孔100 μ 1，37°C孵育Ih ;PBST洗滌后，TMB顯色，酶聯(lián)檢測儀測定OD45tl的值，判定 檢測抗原的最佳包被濃度。
[0066] 根據(jù)方陣試驗確定的檢測抗原的包被濃度，將稀釋后的檢測抗原100 μ 1/孔加入 酶標(biāo)板中，4°C過夜，PBST洗液洗滌3次，5min/次，用含1 % BSA的PBST洗液，37°C封閉2h， 洗滌，拍干_20°C保存，用于篩選陽性細(xì)胞克隆。
[0067] 4.篩選陽性克隆
[0068] 采用建立好的間接ELISA方法檢測雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的情況。具體方法如下：
[0069] 將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清加入預(yù)先包被好的ELISA板中，100 μ 1/孔，以SP2/0細(xì)胞 上清作為陰性對照，免疫鼠多抗血清作為陽性對照，37°C水浴2h ;PBST洗滌3次；加入工作 濃度的HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG抗體，100 μ 1/孔，37°C水浴Ih ;洗滌后，TMB顯色5-10min，顯 色終止后酶標(biāo)儀測定0D450讀數(shù)。被測孔0D450讀數(shù)大于陰性對照兩倍以上判定為陽性。 將篩選到的陽性克隆命名為雜交瘤細(xì)胞株5F8。
[0070] 5.陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化
[0071] 采用有限稀釋法對篩選到的陽性細(xì)胞克隆5F8進行2-3次的亞克隆并進行保藏。 陽性細(xì)胞克隆5F8對應(yīng)保藏號為CCTCC NO !C201563的雜交瘤細(xì)胞株。
[0072] 實施例2沙門菌SpiC蛋白單抗制備
[0073] 1.腹水制備
[0074] 采用體內(nèi)誘生腹水法，按常規(guī)方法進行。10-12周齡健康BALB/c小鼠腹腔注射 液體石蠟〇. 3-0. 5ml/只，7-10d后，分別腹腔接種經(jīng)PBS稀釋的培養(yǎng)至對數(shù)生長期的雜交 瘤細(xì)胞3G9，3B2，4D9，4F7，5F8，5F8和6B9，5 X IO5個細(xì)胞/只；7d后收集腹水，離心去除 沉淀，收集上清，間接ELISA法測定抗體效價，分裝，-70°C保存。雜交瘤細(xì)胞株CCTCC NO: C201563 (對應(yīng)雜交瘤細(xì)胞5F8)分泌的單抗記為5F8。
[0075] 2.抗體純化標(biāo)記
[0076] 將制備的5F8腹水使用Protein G親和層析方法進行純化，并將單抗5F8進行辣 根過氧化物酶標(biāo)記。
[0077] 將純化5F8單抗采用標(biāo)準(zhǔn)辣根過氧化酶標(biāo)記法進行標(biāo)記。具體方法如下：
[0078] 稱取2mgHRP溶解于0. 5ml蒸餾水中。于上液中加入0. 5ml新配的0. 06M NaKM 溶液，4度避光30分鐘。上液中加入160mM的乙二醇0. 5ml，室溫30分鐘。上液中加入IgG 2mg，混勻。將上述溶液裝入透析袋中，置2000ml的0.05mM CB Buffer中透析，4°C攪拌過 夜。（0· 05M CB Buffer :Na2C033. 18g+NaHC035. 88g，up to 2L 蒸餾水）。透析液吸至 15ml 的離心管中，加0. 2ml新配的5mg/ml NaBH4液，混勻，再置4°C 2小時。加入等量的飽和硫 酸銨溶液，4度30分鐘，4度離心4000rpm，20分鐘。棄上清，瀝干。將沉淀溶于少量PBS中 (0·02Μ，ρΗ7·4)，裝入透析袋中，對(X02M pH7.4PBS透析，4°C過夜（中途換PBS-次）。將 透析液中液體吸至EP管中，離心，將上清液吸出，加等量甘油，混勻，-20度保存即可。
[0079] 實施例3單克隆抗體特性檢測
[0080] 1.單抗亞類的鑒定
[0081] 按單克隆抗體亞類試劑盒說明書進行，采用抗原介導(dǎo)的ELISA法。取細(xì)胞培養(yǎng)上 清加入已包被檢測原的ELISA板中，100 μ 1/孔，37°C孵育Ih ;PBST洗滌3次，加入1:1000 稀釋的羊抗鼠 IgA、IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM，100 μ 1/孔，每個亞類做兩個重復(fù)孔， 37°C孵育30min ;PBST洗滌3次，加入1:5000稀釋的兔抗羊酶標(biāo)二抗，100 μ 1/孔，37°C孵 育15min ;PBST洗滌3次，TMB顯色lOmin，2mol/L H2SO^止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀出OD 45Qnm的吸 光值，0D45(lnm吸光值最大者即為單抗的亞類。
[0082] 結(jié)果顯示，5F8為IgGl。
[0083] 2.單抗腹水效價的測定
[0084] 使用包被緩沖液將檢測抗原稀釋至一定濃度，每孔50 μ 1包被ELISA板，4°C過夜； PBST洗滌3次，每孔加入200 μ 1封閉液，37°C封閉a ;將單抗腹水倍比稀釋，每孔100 μ 1， 同樣倍數(shù)稀釋SP2/0腹水作為陰性對照，37°C孵育2h ;用PBST洗滌3次，加入工作濃度的 酶標(biāo)二抗，每孔100 μ 1，37°C孵育Ih ;PBST洗滌后，TMB顯色，酶聯(lián)檢測儀測定OD45tl的值，以 P/N值多2. 1為判定標(biāo)準(zhǔn)，測定單抗腹水效價。
[0085] 結(jié)果顯示，單抗5F8效價為1 :4096000。
[0086] 3.單抗特異性的鑒定
[0087] (1)以Western blotting鑒定單抗的特異性，具體步驟如下：將重組菌 BL21(DE3) (pET)、BL21(DE3) (pET-spiC)裂解上清和 rHis-SpiC 純化蛋白、以及重組菌 BL21 (pGEX-6p-l)、BL21 (pGEX-6p-1-spiC)裂解上清和 rGST-SpiC 純化蛋白，用 5 X SDS Loading Buffer 稀釋后，100°C沸煮 10min，進行 SDS-PAGE 電泳。然后在 Bio-Rad sem