用于dna提取的洗滌液及其應(yīng)用和dna提取試劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物樣品提取領(lǐng)域，尤其涉及一種用于DNA提取的洗滌液。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因組是1924年提出的用于描述生物的全部基因和染色體組成的概念。1986年 由美國科學家Thomas Roderick提出的基因組學是指對所有基因進行基因組作圖（包括遺 傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄本圖譜）、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一門科學。 自從1990年人類基因組計劃實施以來，基因組學發(fā)生了翻天覆地的變化，已經(jīng)發(fā)展成了一 門生命科學的前沿和熱點領(lǐng)域。而植物基因組研宄與其他真核生物和人類基因組研宄有很 大的不同。首先，不同植物的基因組大小即使在親緣關(guān)系非常近的種類質(zhì)檢差別也很大；其 次，很多植物是異源多倍體，即使是二倍體植物中有些種類也存在較為廣泛的體細胞多倍 化現(xiàn)象。
[0003] 目前，植物基因組的研宄主要包括兩個層次：（1)結(jié)構(gòu)基因組學，以全序列測序為 目標，構(gòu)建高分辨率的以染色體重組交換為基礎(chǔ)的遺傳圖譜和以DNA的和核苷酸序列為基 礎(chǔ)的物理圖譜；（2)功能基因組學，即"后基因組計劃"，是結(jié)構(gòu)基因組研宄的延伸，利用結(jié) 構(gòu)基因組提供的遺傳信息，利用表達序列標簽，建立以轉(zhuǎn)錄圖譜為基礎(chǔ)的功能圖譜。
[0004] 在不同層次的植物基因組研宄中，其所涉及到的多數(shù)為分子生物學技術(shù)，目前常 見有：植物基因組測序、植物基因組甲基化分析、植物基因組原位雜交、植物DNA條形碼分 析等。
[0005] 無論是植物基因組不同層次的研宄，還是植物基因組在各種技術(shù)上的應(yīng)用，其首 要前提均是獲得高質(zhì)量的植物基因組DNA。而評價植物基因組DNA的質(zhì)量的一個重要指標 就是濃度與純度，這直接關(guān)系到植物基因組的后期應(yīng)用能否有效開展。而與細菌、動物組 織、細胞等生物材料不同，大部分植物都含有較高水平的多糖、多酚等，這些物質(zhì)會嚴重干 擾植物基因組DNA提取結(jié)果，尤其會嚴重降低植物基因組DNA的純度，使得下游的研宄受到 干擾，嚴重影響應(yīng)用效果。
[0006] 為了有效地去除植物基因組DNA提取過程中的多糖、多酚等污染，提高基因組DNA 的純度，不同的學者和研宄者嘗試了不同的方法=Dellaporta等認為高濃度的KAc能有效 去除多糖；Fang等認為I. 0-2. 5M的NaCl配合無水乙醇沉淀能有效去除多糖的污染；有人 利用PVP這種高分子合成樹脂絡(luò)合植物基因組DNA提取過程中的多酚物質(zhì)，以達到去除多 酚的目的；還有人采用DTTD來對多酚進行有效去除。然而，上述這些方法也只能去除一般 植物中的多糖多酚，當用這些方法處理多糖多酚含量較高的植物物種時，其效果并不理想 且其應(yīng)用在物種之間的差異較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供用于DNA提取的洗滌液，包括鹽 酸胍、乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸和2- 丁氧乙醇，pH為6. 8-7. 2。
[0008] 進一步的，所述鹽酸胍的濃度為1M-5M、乙二胺四乙酸二鈉的濃度為lmM-50mM、三 輕甲基氨基甲燒的濃度為10mM-100mM、鹽酸的濃度為〇. 1% -1%，2-丁氧乙醇的濃度為 5% _20%〇
[0009] 更進一步的，所述鹽酸胍濃度為3. 5M，乙二胺四乙酸二鈉濃度為20mM，三羥甲基 氨基甲燒濃度為35mM，鹽酸濃度為0. 6 %，2-丁氧乙醇濃度為10 %。
[0010] 本發(fā)明還提供了所述洗滌液在提取DNA上的應(yīng)用，所述的洗滌液包括鹽酸胍、乙 二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸和2- 丁氧乙醇，pH為6. 8-7. 2。
[0011] 進一步的，所述鹽酸胍的濃度為1M-5M、乙二胺四乙酸二鈉的濃度為lmM-50mM、三 輕甲基氨基甲燒的濃度為10mM-100mM、鹽酸的濃度為〇. 1% -1%，2-丁氧乙醇的濃度為 5% _20%〇
[0012] 更進一步的，所述鹽酸胍濃度為3. 5M，乙二胺四乙酸二鈉濃度為20mM，三羥甲基 氨基甲燒濃度為35mM，鹽酸濃度為0. 6 %，2-丁氧乙醇濃度為10 %。
[0013] 優(yōu)選的，提取的DNA為植物中的DNA。
[0014] 更優(yōu)選的，提取的DNA為蘇木科植物中的DNA。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種用于去除植物基因組純化過程中的多糖和多酚物質(zhì)的試劑， 包括鹽酸胍、乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸和2- 丁氧乙醇，pH為6. 8-7. 2。
[0016] 進一步的，所述鹽酸胍的濃度為1M-5M、乙二胺四乙酸二鈉的濃度為lmM-50mM、三 輕甲基氨基甲燒的濃度為10mM-100mM、鹽酸的濃度為〇. 1% -1%，2-丁氧乙醇的濃度為 5% _20%〇
[0017] 更進一步的，所述鹽酸胍濃度為3. 5M，乙二胺四乙酸二鈉濃度為20mM，三羥甲基 氨基甲燒濃度為35mM，鹽酸濃度為0. 6 %，2-丁氧乙醇濃度為10 %。
[0018] 進一步地，所述植物基因組為蘇木科植物基因組。
[0019] 本發(fā)明提供了一種DNA提取試劑，包括細胞懸浮液、細胞裂解液、洗滌液和洗脫 液，所述洗滌液包括鹽酸胍、乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸和2-丁氧乙醇， pH 值為 6. 8-7. 2。
[0020] 進一步地，所述鹽酸胍的濃度為1M-5M、乙二胺四乙酸二鈉的濃度為lmM-50mM、三 輕甲基氨基甲燒的濃度為10mM-100mM、鹽酸的濃度為〇. 1% -1%、2-丁氧乙醇的濃度為 5% -20%
[0021] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所述的洗滌液能夠廣泛去除不同植物在基因組純化 過程中的多糖多酚等污染，提高純化所得DNA的純度與濃度，有利于下游應(yīng)用，提高檢測靈 敏度。
【附圖說明】
[0022] 圖1酸角樹植物基因組DNA提取結(jié)果。
[0023] 圖2不同蘇木科植物基因組DNA純化結(jié)果。
[0024] 圖3本發(fā)明洗滌液與其他洗滌液的對比實驗結(jié)果。
[0025] 圖4酸角樹不同部位組織基因組DNA純化結(jié)果。
[0026] 圖5不同提取方法配以本發(fā)明洗滌液的效果。
[0027] 圖6本發(fā)明洗滌液應(yīng)用到提取不同科屬植物基因組的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明進行詳細的說明。
[0029] 用于DNA提取的洗滌液包括以下組分：
[0030] 鹽酸胍：1M-5M
[0031] 乙二胺四乙酸二鈉
[0032] 三羥甲基氨基甲烷：IOmM-IOOmM
[0033] 鹽酸：0.1 %-1 %
[0034] 2-丁氧乙醇：5%-20%
[0035] pH ：6. 8-7. 2
[0036] 所述洗滌液可以單獨作為去除植物基因組純化過程中的多糖和/或多酚物質(zhì)的 試劑。
[0037] -種DNA提取試劑，包括細胞懸浮液、細胞裂解液、洗滌液和洗脫液，所述洗 滌液包括鹽酸胍、乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸和2-丁氧乙醇，pH值為 6. 8-7. 2。在一個具體方案中，洗滌液包括1M-5M的鹽酸胍、lmM-50mM的乙二胺四乙酸二鈉、 IOmM-IOOmM的三羥甲基氨基甲烷、0. 1% -1 %的鹽酸和5% -20%的2-丁氧乙醇。
[0038] 本發(fā)明所述洗滌液在基于硅膠柱的DNA提取方法上的應(yīng)用，包括以下步驟：
[0039] 1.稱取一定量的木材樣本，液氮碾磨。
[0040] 2.加入裂解液和蛋白酶K進行裂解。
[0041] 3.離心取上清，加入過柱結(jié)合液。
[0042] 4.將DNA制備管置于新的2ml離心管中，取步驟3中的溶液并轉(zhuǎn)移至制備管中， 12,000 Xg 離心 Imin0
[0043] 5.棄濾液，將制備管置回到原來的2ml離心管中，加入700 μ 1洗滌液，12,000Xg 離心Imin0
[0044] 6.棄濾液，將制備管置回到原來的2ml離心管中，加入700 μ 1去鹽液，12,000Xg 離心Imin0
[0045] 7.重復(fù)步驟6。
[0046] 8.棄濾液，將制備管置回到原來的2ml離心管中，12,000Xg離心lmin。
[0047] 9.將DNA制備管置于另一潔凈的I. 5ml離心管中，在制備管膜中央加100 μ 1去離 子水，室溫靜置lOmin，12,000 X g離心Imin洗脫DNA，獲得基因組DNA。
[0048] 本發(fā)明所述洗滌液在基于納米磁微球的DNA提取方法上的應(yīng)用，包括以下步驟：
[0049] 1.稱取一定量的木材樣本，液氮碾磨。
[0050] 2.加入裂解液和蛋白酶K進行裂解。
[0051] 3.離心取上清，加入磁珠和結(jié)合液。
[0052] 4.將離心管置于磁力架上，待上清液澄清后吸棄上清。
[0053] 5.加700 μ 1洗滌液，渦旋洗滌lmin。
[0054] 6.將2ml離心管置于磁力架上，待上清液澄清后吸棄上清。
[0055] 7.加700 μ 1去鹽液，渦旋洗滌lmin。
[0056] 8.將2ml離心管置于磁力架上，待上清液澄清后吸棄上清。
[0057] 9.重復(fù)步驟7-8。
[0058] 10.短暫離心后吸棄殘余液體，通風櫥干燥。
[0059] 11.加50-100 μ 1去離子水，用槍吹打混勻后渦旋洗脫5min，獲得基因組DNA。
[0060] 對提取的DNA進行qPCR檢測，其中：
[0061] qPCR 擴增條件為：95°C，2min ;95°C 15s，55°C 34s，共 40 個循環(huán)。所述 qPCR 擴增 是在ABI公司的ABI 7500Real Time PCR System完成，也可以在其他的擴增儀器上完成。
[0062] qPCR的反應(yīng)體系為：20 μ 1的體系包括：
[0063]
[0064] 所述上下游引物序列和探針序列分別為：
[0065] Primer UP :5' -CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'
[0066] Primer Down :5' -TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3'
[0067] Prober :5' -GCAATCCTGAGCCAAATCC-3'
[0068] 陽性對照為水稻基因組。
[0069] 根據(jù)qPCR檢測原則，當提取的DNA進行qPCR檢測時，檢測Ct值小于35個循環(huán)，則 表明已成功提取基因組DNA。Ct值越小，表明提取獲得的基因組DNA的量越多，純度越高。
[0070] 實施例1本發(fā)明洗滌液用于木材DNA提取和純化
[0071] 利用本發(fā)明所述洗滌液，采用硅膠柱提取法提取IOOmg木材中的DNA，包括如下步 驟：
[0072] 1.稱取木材100mg，加入液氮，在研缽中研磨成粉末，立即轉(zhuǎn)移至2ml離心管中。
[0073] 2.加入900 μ 165°C預(yù)熱的裂解液和20 μ I Proteinase K，蓋上管蓋并封嚴管口， 渦旋振蕩30s，混合均勻，65°C水浴0. 5h-過夜。
[0074] 3.冷卻至室溫，加入125 μ 1助沉劑，渦旋Imin后冰浴10min。
[0075] 4. 12,000 Xg離心10min，取上清液700 μ 1至新的2ml離心管中，加入20 μ 1結(jié)合 液和2 μ I Carrier RNA，混合均勻后加入約0. 5倍上清液體積的異丙醇，渦旋混勻30s。
[0076] 5.將DNA制備管置于新的2ml離心管中，取600 μ 1步驟4中的混合液并轉(zhuǎn)移至制 備管中，12,000Xg離心lmin。
[0077] 6.棄濾液，將制備管置回到原來的2ml離心管中，將步驟4中剩余的混合液轉(zhuǎn)移至 制備管中，12,000Xg離心lmin。
[0078] 7.棄濾液，將制備管置回到原來的2ml離心管中，加