入700 μ 1洗滌液，12,000Xg 離心Imin0
[0079] 8.棄濾液，將制備管置回到原來(lái)的2ml離心管中，加入700 μ 1去鹽液，12,000Xg 離心Imin0
[0080] 9.重復(fù)步驟8。
[0081] 10.棄濾液，將制備管置回到原來(lái)的2ml離心管中，12,000Xg離心lmin。
[0082] 11.將DNA制備管置于另一潔凈的I. 5ml離心管中，在制備管膜中央加100 μ 1去 離子水，室溫靜置lOmin，12,000 X g離心Imin洗脫DNA，獲得基因組DNA。
[0083] 利用本發(fā)明所述洗滌液，采用納米磁微珠提取法提取IOOmg木材中的DNA，包括如 下步驟：
[0084] 1.稱取木材lOOmg，加入液氮，在研缽中研磨成粉末，立即轉(zhuǎn)移至2ml離心管中。
[0085] 2.加入900 μ 165°C預(yù)熱的裂解液和20 μ IProteinase K，蓋上管蓋并封嚴(yán)管口， 渦旋振蕩30s，混合均勻，65°C水浴0. 5h-過(guò)夜。
[0086] 3.冷卻至室溫，加入125 μ 1助沉劑，渦旋Imin后冰浴lOmin。
[0087] 4. 12,000 X g離心10min，取上清液700 μ 1至新的2ml離心管中，加入20 μ 1磁珠、 2 μ ICarrier RNA，渦旋混勻后加入約1. 25倍上清液體積的異丙醇，渦旋混勻lOmin。
[0088] 5.將2ml離心管置于磁力架上，待上清液澄清后吸棄上清。
[0089] 6.加700 μ 1洗滌液，渦旋洗滌lmin。
[0090] 7.將2ml離心管置于磁力架上，待上清液澄清后吸棄上清。
[0091] 8.加700 μ 1去鹽液，渦旋洗滌lmin。
[0092] 9.將2ml離心管置于磁力架上，待上清液澄清后吸棄上清。
[0093] 10.重復(fù)步驟 8-9。
[0094] 11.短暫離心后吸棄殘余液體，通風(fēng)櫥干燥。
[0095] 12.加50-100 μ 1去離子水，用槍吹打混勻后渦旋洗脫5min，獲得基因組DNA。
[0096] 實(shí)施例2純化酸角樹植物基因組DNA
[0097] 提取酸角樹植物基因組DNA，并利用本發(fā)明所述洗滌液進(jìn)行洗滌，利用qPCR方法 對(duì)提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)，其中洗滌液的配方組分包括：
[0098] 鹽酸胍：3. 5M
[0099] 乙二胺四乙酸二鈉：20mM
[0100] 三羥甲基氨基甲烷：35mM
[0101] 鹽酸：0.6%
[0102] 2-丁氧乙醇：10%
[0103] pH ：6. 8-7. 2
[0104] 結(jié)果如圖1，表明本實(shí)施例的Ct值為26. 81，即本發(fā)明所述洗滌液能夠有效去除植 物中的多酚、多糖等雜質(zhì)，最終獲取高純度的植物基因組DNA。
[0105] 實(shí)施例3純化不同蘇木科植物樣本的基因組DNA
[0106] 提取蘇木科不同植物基因組DNA，采用本發(fā)明洗滌液進(jìn)行洗滌，洗滌液的pH值為 6. 8-7. 2。洗滌液具體的配方如下，包括：
[0107]
[0108] 結(jié)果如圖2,表明本發(fā)明所述洗滌液能夠有效去除不同蘇木科植物基因組提取時(shí) 的多糖多酚等雜質(zhì)污染，最終獲取高純度的植物基因組DNA。
[0109] 實(shí)施例4不同洗滌液配方的效果
[0110] 按實(shí)施例1所述的硅膠柱法提取酸角樹植物基因組DNA，采用本發(fā)明洗滌液進(jìn)行 洗滌（實(shí)驗(yàn)組），并將其與目前市場(chǎng)上的商品化的洗滌液（對(duì)照組）進(jìn)行對(duì)比，其對(duì)照組1 的洗滌液來(lái)自Qiagen品牌、對(duì)照組2的洗滌液來(lái)自O(shè)mega品牌、對(duì)照組3的洗滌液來(lái)自天 根品牌、對(duì)照組4的洗滌液來(lái)自《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》（第五版，科學(xué)出版社）的經(jīng)典 配方。本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)組洗滌液的配方包括：
[0111] 鹽酸胍：1. 5M
[0112] 乙二胺四乙酸二鈉：5mM
[0113] 三羥甲基氨基甲烷：15mM
[0114] 鹽酸：0.2%
[0115] 2-丁氧乙醇：5%
[0116] pH ：6. 8-7. 2
[0117] 結(jié)果如圖3,表明本發(fā)明所述的洗滌液在進(jìn)行蘇木科植物基因組DNA提取時(shí)，其Ct 最小，表明其在提高基因組純度方面具有顯著的效果。
[0118] 實(shí)施例5酸角樹植物不同部位基因組DNA提取
[0119] 利用實(shí)施例1所述納米磁微珠提取法，提取酸角樹不同部位的組織基因組DNA，所 述洗滌液配方包括：
[0120] 鹽酸胍：4. 5M
[0121] 乙二胺四乙酸二鈉：70mM
[0122] 三羥甲基氨基甲烷：80mM
[0123] 鹽酸：0.9%
[0124] 2-丁氧乙醇：18%
[0125] pH ：6. 8-7. 2
[0126] 結(jié)果如圖4,本發(fā)明所述洗滌液用于蘇木科植物不同部位的組織基因組DNA純化 中，能夠有效去除多糖多酚的污染，提高純化所得基因組DNA的純度。
[0127] 實(shí)施例6酸角樹植物基因組DNA不同提取方法配以本發(fā)明洗滌液的效果測(cè)試
[0128] 采用不同的提取方法對(duì)酸角樹植物基因組DNA進(jìn)行提取，然后配以本發(fā)明所述洗 滌液（實(shí)驗(yàn)組），測(cè)試其純化效果，并將其與原有方法中的洗滌液（對(duì)照組）進(jìn)行對(duì)比。分 別測(cè)試改良的CTAB法、PTB法、高鹽低pH法、Qiagen試劑盒法。
[0129] 本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)組的洗滌液配方包括：
[0130] 鹽酸胍：3. 5M
[0131] 乙二胺四乙酸二鈉：20mM
[0132] 三羥甲基氨基甲烷：35mM
[0133] 鹽酸：0.6%
[0134] 2-丁氧乙醇：10%
[0135] pH ：6. 8-7. 2
[0136] 采用改良的CTAB法提取DNA，所述改良的CTAB法參見(jiàn)：王關(guān)林、方洪筠。植物基 因工程（第二版），北京科學(xué)出版社，2002. 744。其中實(shí)驗(yàn)組的洗滌液采用本實(shí)施例所述的 洗滌液，對(duì)照組1的洗滌液為該書本中原有的洗滌液。
[0137] 采用PTB法提取DNA，其中PTB法試劑包括：PTB (溴化N-苯乙酰胺）、EDTA、蛋白 酶K、酚氯仿、氯仿異戊醇、無(wú)水乙醇、醋酸銨、TE。PTB法操作步驟包括：（1)用EDTA浸泡木 材粉末48h使木材脫礦。（2)脫礦結(jié)束后，加蛋白酶K和PTB溶液在65度水浴12h。（3)水 浴結(jié)束后加酚氯仿抽提一次。（4)離心后取上清，加氯仿異戊醇抽提一次。（5)重復(fù)步驟4。 (6)加入無(wú)水乙醇及醋酸銨，在-20度冰箱中存儲(chǔ)12h沉淀DNA。（7)離心得DNA沉淀用洗 滌液洗滌2次并在80%乙醇中靜置過(guò)夜。（8)離心得干凈的DNA沉淀，干燥后用TE溶液溶 解DNA。其中實(shí)驗(yàn)組的洗滌液采用本實(shí)施例所述的洗滌液，對(duì)照組2的洗滌液為80%乙醇。
[0138] 采用高鹽低pH法提取DNA，其中高鹽低pH法試劑包括：CTAB、5M NaCl、EDTA、Tris、 35%乙醇、洗滌液、無(wú)水乙醇及TE。高鹽低pH法操作步驟包括：（1)在木材粉末中加 CTAB 提取液，混勻后65度水浴2h。（2)在水浴結(jié)束后加35%乙醇混勻后離心。（3)取上清液， 加酚氯仿抽提一次。（4)離心后取上清，加氯仿異戊醇抽提一次。（5)重復(fù)步驟4。（6)取 上清液，加5M的NaCl和無(wú)水乙醇，混勻后沉淀DNA，離心收集DNA。（7) DNA沉淀用洗滌液洗 滌。（8)干燥后用TE溶解DNA。其中實(shí)驗(yàn)組的洗滌液采用本實(shí)施例所述的洗滌液，對(duì)照組 3的洗滌液為70 %乙醇。
[0139] 采用Qiagen試劑盒法提取DNA，試劑盒名稱為DNeasy Plant Mini Kit以及需要 使用 DNeasy Plant Maxi Kit 中的 QIAshreder Maxi spin column。其中實(shí)驗(yàn)組的洗絳液 采用本實(shí)施例所述的洗滌液，對(duì)照組4的洗滌液為Qiagen試劑盒中提供的洗滌液。
[0140] 結(jié)果如圖5,表明使用本發(fā)明所述洗滌液，將其與不同的蘇木科植物基因組DNA提 取方法配合使用，可以取得比原有方法中洗滌液更好的效果。
[0141] 實(shí)施例7本發(fā)明洗滌液在不同種類植物基因組純化中的應(yīng)用
[0142] 本實(shí)施例將本發(fā)明洗滌液分別對(duì)闊葉黃檀（豆科植物）、長(zhǎng)葉槭（槭樹科植物）、 亞麻（亞麻科植物）、馬錢子（馬錢科植物）、假絲蘭（龍舌蘭科植物）、廣玉蘭（木蘭科植 物）、夾竹桃（夾竹桃科植物）、冬青（動(dòng)情科植物）的木質(zhì)部DNA進(jìn)行純化。
[0143] 本實(shí)施例所述洗滌液配方如下：
[0144] 鹽酸胍：3. 5M
[0145] 乙二胺四乙酸二鈉：20mM
[0146] 三羥甲基氨基甲烷：35mM
[0147] 鹽酸：0.6%
[0148] 2-丁氧乙醇：10%
[0149] PH ：6. 8-7. 2
[0150] 利用實(shí)施例1所述方法提取DNA，并配以本實(shí)施例所述洗滌液，提取結(jié)果如圖6所 示。本發(fā)明所述洗滌液能提高不同種類植物基因組提取的提取效果。
[0151] 本發(fā)明洗滌液能夠廣泛去除不同植物在基因組純化過(guò)程中的多糖、多酚等污染。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于DNA提取的洗滌液，包括鹽酸胍、乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸 和2- 丁氧乙醇，pH值為6. 8-7. 2。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的洗滌液，其特征在于，所述鹽酸胍的濃度為1M-5M、乙二胺 四乙酸二鈉的濃度為lmM-50mM、三羥甲基氨基甲烷的濃度為10mM-100mM、鹽酸的濃度為 0? 1% -1%、2-丁氧乙醇的濃度為5% -20%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的洗滌液，其特征在于，所述鹽酸胍濃度為3. 5M，乙二胺四乙 酸二鈉濃度為20mM，三輕甲基氨基甲燒濃度為35mM，鹽酸濃度為0. 6 %，2- 丁氧乙醇濃度為 10%〇4. 洗滌液在提取DNA上的應(yīng)用，其特征在于，所述的洗滌液包括鹽酸胍、乙二胺四乙酸 二鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸和2- 丁氧乙醇，pH為6. 8-7. 2。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述鹽酸胍的濃度為1M-5M、乙二胺 四乙酸二鈉的濃度為lmM-50mM、三羥甲基氨基甲烷的濃度為10mM-100mM、鹽酸的濃度為 0? 1% -1 %，2-丁氧乙醇的濃度為5% -20%。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述鹽酸胍濃度為3. 5M，乙二胺四乙酸 二鈉濃度為20mM，三輕甲基氨基甲燒濃度為35mM，鹽酸濃度為0. 6%，2- 丁氧乙醇濃度為 10%〇7. 根據(jù)權(quán)利要求4至6之一所述的應(yīng)用，其特征在于，提取的DNA為植物中的DNA。8. 根據(jù)權(quán)利要求4至6之一所述的應(yīng)用，其特征在于，提取的DNA為蘇木科植物中的 DNA0 9. DNA提取試劑，包括細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞裂解液、洗滌液和洗脫液，其特征在于，所述 洗滌液包括鹽酸胍、乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸和2-丁氧乙醇，pH值為 6. 8~7, 2〇10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA提取試劑，其特征在于，所述鹽酸胍的濃度為1M-5M、乙 二胺四乙酸二鈉的濃度為lmM-50mM、三羥甲基氨基甲烷的濃度為10mM-100mM、鹽酸的濃度 為0? 1% -1%、2-丁氧乙醇的濃度為5% -20%。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于DNA提取的洗滌液，包括鹽酸胍，乙二胺四乙酸二鈉，三羥甲基氨基甲烷，鹽酸和2-丁氧乙醇，pH值為6.8-7.2。本發(fā)明所述的洗滌液能夠廣泛去除不同植物在基因組純化過(guò)程中的多糖、多酚等污染，提高純化所得DNA的純度與濃度，有利于下游應(yīng)用，提高檢測(cè)靈敏度。
【IPC分類】C12N15/10
【公開(kāi)號(hào)】CN104928283
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510330938
【發(fā)明人】林源吉, 丁佳女
【申請(qǐng)人】杭州百邁生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年9月23日
【申請(qǐng)日】2015年6月9日