基于pcr引物3’末端核苷酸雙脫氧修飾的乳腺癌易感基因snp快速、靈敏檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和核酸分子檢測領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及基于 PCR引物3'末端核苷酸雙脫氧修飾的乳腺癌易感基因 SNP快速、靈敏檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌作為女性癌癥的第一大殺手，近些年在世界范圍內(nèi)已備受關(guān)注。據(jù)估計(jì)，僅 2007年，全球就有130萬乳腺癌新發(fā)患者，有超過46萬的患者死于該病。就中國而言，根據(jù) 2003~2007年全國32個(gè)腫瘤登記點(diǎn)的資料分析報(bào)告以及2008年世界衛(wèi)生組織（WHO)國 際癌癥研究中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示：近年來乳腺癌的發(fā)病率高居中國女性惡性腫瘤的首位， 并以3%以上的速度逐年遞增；保守估計(jì)全國每年有4萬多婦女死于此病，死亡率已居第6 位。
[0003] 已證實(shí)，乳腺癌的發(fā)生與遺傳易感性、女性內(nèi)分泌失調(diào)、哺乳過程中病毒的感染等 幾大因素密切相關(guān)。這其中，遺傳易感性（遺傳背景）扮演了重要角色。因?yàn)閾?jù)流行病學(xué) 研究顯示，乳腺癌患者的一級(jí)親屬患此病的風(fēng)險(xiǎn)要顯著高于普通人群，且年齡越小，風(fēng)險(xiǎn)越 大。因而該病具有明顯的家族遺傳傾向。而這種遺傳傾向主要是由于基因突變造成的。這 其中，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP)系主要組成部分。
[0004] 目前為止，研究已發(fā)現(xiàn)一系列與乳腺癌發(fā)生密切相關(guān)的乳腺癌易感基因 （breast cancer susc印tibility genes)，如 BRCA1、BRCA2、TP53、CHEK2、MAP3K1、T0X3、RAD50、ATM 等。這其中，BRCAl與BRCA2是最重要的2個(gè)易感基因。其突變，尤其是外顯子的SNPs與 遺傳性乳腺癌及早發(fā)性乳腺癌的高度相關(guān)性已被證實(shí)。
[0005] 由于這些基因中廣泛存在的SNPs與乳腺癌的發(fā)生具有密切聯(lián)系，再加上SNP已成 為繼限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)和微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR)之后的第三代遺傳標(biāo)記，因此近年 來SNP檢測技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展也十分迅速，已涌現(xiàn)出許多不同的SNP檢測方法（技術(shù)），包括：
[0006] (1)直接測序法。通常采取的做法是對(duì)可能含有SNP的目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行測序。由于這種方法最直接、可靠，因此也被認(rèn)為是確認(rèn)突變結(jié)果的"金標(biāo)準(zhǔn)"方法。但 其不可避免的缺點(diǎn)是通量低、耗時(shí)長；近年發(fā)展起來的高通量測序技術(shù)（如焦磷酸測序）雖 然具有高效、快速、可深度測序的優(yōu)勢，也被諸多研究機(jī)構(gòu)廣泛采用，但其配套儀器、試劑的 花費(fèi)非常昂貴。
[0007] (2)限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)。這是一種較早的SNP檢測方法。其依據(jù)的原 理是每種限制性內(nèi)切酶都具有嚴(yán)格、專一的酶切識(shí)別位點(diǎn)。如果基因某位點(diǎn)處的堿基發(fā)生 了改變而導(dǎo)致該處的若干個(gè)堿基恰好成為了某種限制性內(nèi)切酶的切割識(shí)別位點(diǎn)，那么經(jīng)該 酶作用并經(jīng)電泳分離后，會(huì)檢測到2個(gè)不同的DNA片段；反之若該位點(diǎn)處堿基沒有發(fā)生改 變，則不會(huì)被此限制酶識(shí)別和作用，因此經(jīng)電泳分離后，仍是原始的一個(gè)片段，不會(huì)產(chǎn)生兩 個(gè)片段。這種方法原理簡便、操作易行且結(jié)果可靠，也被人們認(rèn)為是一種檢測SNP的標(biāo)準(zhǔn)方 法。但其明顯的缺陷是，一種酶往往只能針對(duì)性地檢測一個(gè)或幾個(gè)SNP位點(diǎn)，而且目前發(fā)現(xiàn) 的限制性內(nèi)切酶的種類是有限的，并非每一個(gè)SNP都有對(duì)應(yīng)的一種酶可以作用，限制了該 方法的應(yīng)用。
[0008] (3)蛋白阻斷實(shí)驗(yàn)（PTT)。這種方法主要是通過對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物--蛋白質(zhì)片段 大小的分析來檢測SNP的。由于這種方法只適用于檢測SNP中，小片段的增添、缺失等可造 成翻譯提前終止的移碼突變，因此常作為其他SNP檢測方法的一種輔助性驗(yàn)證手段，目前 已不單獨(dú)用于SNP檢測。
[0009] (4)基于DNA分子化學(xué)結(jié)構(gòu)分析的方法。主要有單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP)、異源雙 鏈分析（HA)等。
[0010] (5)高分辨率熔解曲線分析。這是一種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative-PCR)的分析方法。雖然檢測準(zhǔn)確度也令人滿意，但實(shí)驗(yàn)當(dāng)中為獲得高分辨率 的熔解曲線，多數(shù)要用到飽和熒光染料，因而提高了實(shí)驗(yàn)的成本，一定程度上限制了該方法 的應(yīng)用。
[0011] (6)引物延伸法。這種方法主要是一種基于PCR反應(yīng)的檢測方法。其主要原理是 針對(duì)涉及某SNP位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因分別設(shè)計(jì)兩條不同的特異性辨別引物，使之3'末端恰 好位于SNP處，再在其上游（或下游）設(shè)計(jì)一條共用引物，這樣一條共用引物與兩條等位基 因特異性引物分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，只有SNP位點(diǎn)與特異性引物的3'末端互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，引物才 能順利延伸，擴(kuò)增得到片段。跟據(jù)PCR反應(yīng)后的情況可以推測兩個(gè)等位基因的SNP位點(diǎn)處 的突變情況。這種方法具備了常規(guī)PCR反應(yīng)簡便易行，應(yīng)用廣泛、無需昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu) 點(diǎn)。但值得一提的是，這種方法常會(huì)不可避免地產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此一定程度上影響了該 方法的準(zhǔn)確度。此外，還有ddNTP單堿基延伸結(jié)合質(zhì)譜檢測法，也屬于引物延伸法的范疇。
[0012] 以上是一些常用的早期SNP檢測方法。目前發(fā)展起來的新方法還有：SNP基因芯 片技術(shù)，在一塊很小的芯片上就可排列多達(dá)數(shù)十萬個(gè)SNP特異性標(biāo)記探針，可對(duì)大量DNA樣 品同時(shí)檢測；變性高效液相色譜法（DHPLC)、引物延伸結(jié)合飛行時(shí)間質(zhì)譜分析（MALDI-T0F MS)、動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交（DASH)等。它們與傳統(tǒng)方法相比，在檢測通量、準(zhǔn)確度上有 了很大的提高，但與此同時(shí)，由于都用到了某些最新的儀器、技術(shù)，因此檢測成本也相對(duì)較 高，尤其是當(dāng)檢測樣品規(guī)模較少時(shí)，這一點(diǎn)更加突出。故短時(shí)間內(nèi)還無法實(shí)現(xiàn)廣泛的應(yīng)用。
[0013] 由此可見，作為"金標(biāo)準(zhǔn)"的測序法雖然直接、準(zhǔn)確，但耗時(shí)、耗力；其它傳統(tǒng)方法雖 然簡便易行，但或多或少都具有應(yīng)用范圍窄、準(zhǔn)確度較低等不同的弊端；近年發(fā)展起來的一 些新方法，由于依托了最新的儀器設(shè)備，因此往往具有高通量、高準(zhǔn)確度的優(yōu)點(diǎn)，但成本昂 貴、原理復(fù)雜也是限制其廣泛應(yīng)用的一個(gè)主要原因。綜合考慮，目前被各個(gè)實(shí)驗(yàn)室廣泛采用 的仍以經(jīng)過改進(jìn)的傳統(tǒng)方法為主。這其中，最有價(jià)值、應(yīng)用最靈活的還屬PCR引物延伸法。
[0014] 但是如上所述，早期的等位基因特異性PCR方法雖然簡便易行，只需設(shè)計(jì)3條引 物，兩個(gè)常規(guī)的PCR反應(yīng)即可達(dá)到SNP檢測與分型兩個(gè)目的，但假陽性的產(chǎn)生卻嚴(yán)重限制了 這種方法的準(zhǔn)確度。因此這種原始方法現(xiàn)在已不常用，取而代之的是基于該理論的一系列 改進(jìn)方法，如人為摻入錯(cuò)配堿基，加大區(qū)分度；增加外圍引物進(jìn)行巢式PCR，提高準(zhǔn)確度等。 但是值得注意的是，假陽性的產(chǎn)生是由這種方法的原理決定的，因此這些諸多的改進(jìn)，都不 能100%避免假陽性的產(chǎn)生。故而，一種簡便易行、可操作性強(qiáng)，而又具有相當(dāng)準(zhǔn)確度、高效 經(jīng)濟(jì)的通過PCR反應(yīng)檢測SNP的方法對(duì)于核酸分子診斷、遺傳學(xué)分析等領(lǐng)域是迫切需要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的目的在于提供基于PCR引物3'末端核苷酸雙脫氧修飾的乳腺癌易感基 因 SNP快速、靈敏檢測方法。
[0016] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種乳腺癌易感基因單核苷酸多態(tài)性檢測方法，所述 方法包括：
[0017] (1)針對(duì)一個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，以正向引物和反向引物為引物對(duì)，以同時(shí)含有 高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶的混合體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述的正向或反向引 物中任一條為辨別性引物，以其3'末端堿基起算第1-6位的任意1個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)應(yīng)待測 位點(diǎn)，但與野生型序列相應(yīng)區(qū)段上堿基序列完全匹配；且，所述的辨別性引物的3'末端核 苷酸經(jīng)過2'，3' -雙脫氧修飾，其長度為20~40mer ;
[0018] 所述的引物對(duì)中，辨別性引物以外的另一引物位于基因突變位點(diǎn)下游或上游且與 相應(yīng)區(qū)段上堿基序列完全匹配，其長度為20~40mer ;
[0019] (2)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若獲得目的擴(kuò)增產(chǎn)物，則表明待測基因的待測位點(diǎn)存在突 變，基因型為突變型；若未獲得目的擴(kuò)增產(chǎn)物，則表明待測基因的待測位點(diǎn)不存在突變，基 因型為野生型。
[0020] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種乳腺癌易感基因單核苷酸多態(tài)性檢測方法，所述 方法包括：
[0021] (1)針對(duì)一個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，以正向引物和反向引物為引物對(duì)，以同時(shí)含有 高保真DNA聚合酶和非高保真DNA聚合酶的混合體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述的正向或反向引 物中任一條為辨別性引物，以其3'末端堿基起算第1-6位的任意1個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)應(yīng)待測 位點(diǎn)，但與突變型序列相應(yīng)區(qū)段上堿基序列完全匹配；且，所述的辨別性引物的3'末端核 苷酸經(jīng)過2'，3' -雙脫氧修飾，其長度為20~40mer ;
[0022] 所述的引物對(duì)中，辨別性引物以外的另一引物位于基因突變位點(diǎn)下游或上游且與 相應(yīng)區(qū)段上堿基序列完全匹配，其長度為20~40mer ;
[0023] (2)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若獲得目的擴(kuò)增產(chǎn)物，則表明待測基因的待測突變位點(diǎn)不 存在突變，基因型為野生型；若未獲得目的擴(kuò)增產(chǎn)物，則表明待測基因的待測突變位點(diǎn)存在 突變，基因型為突變型。
[0024] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的突變包括：點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法用于