命名方式，例如185delAG表 示BRCAl基因 mRNA序列第185位（位于外顯子2)缺失A和G ;又例如300T>G表示BRCAl基 因 mRNA序列第300位（位于外顯子5)由野生型的T突變?yōu)镚 ;又例如5382insC表示BRCAl 基因 mRNA序列第5382位與5383位（位于外顯子20)之間插入一個(gè)C ;又例如999del5表 示BRCA2基因 mRNA序列第998位（位于外顯子9)起缺失5個(gè)堿基。其它突變位點(diǎn)的命名 以此類推。
[0065] 本發(fā)明人通過針對不同的乳腺癌易感基因 SNP(熱點(diǎn)突變）設(shè)計(jì)不同的引物，并對 每對引物中的一條引物的3'末端核苷酸進(jìn)行2'，3' -雙脫氧修飾從而造成"封閉"效果， 再結(jié)合反應(yīng)體系中高保真DNA聚合酶的3'，5' -核酸外切酶活性，從而達(dá)到有效檢測（區(qū) 分）各乳腺癌易感基因 SNP的目的。本發(fā)明的方法只需針對待檢測的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對引 物，通過一個(gè)常規(guī)PCR反應(yīng)，外加凝膠電泳（瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠）分離，即可達(dá) 到檢測SNP基因型的目的。經(jīng)驗(yàn)證，本發(fā)明的方法操作簡單，無需昂貴、復(fù)雜的儀器、試劑， 且靈敏度高、重現(xiàn)性好。適用于乳腺癌易感基因 SNP的檢測以及其它相關(guān)基因 SNP的檢測。 [0066] 本發(fā)明通過PCR反應(yīng)檢測SNP的原理為：通過設(shè)計(jì)一條3'末端核苷酸經(jīng)2'，3' -雙 脫氧修飾的引物，使其自3'末端起的1-6個(gè)堿基完全覆蓋待測的SNP位點(diǎn)（最好是3'末 端恰好位于SNP處），且引物序列和基因型為野生型的等位基因序列完全互補(bǔ)配對。這樣 再加上另外一條下游（或上游）引物，與待測DNA樣品一同進(jìn)行PCR反應(yīng)，當(dāng)待測DNA樣品 SNP位點(diǎn)處的基因型為野生型時(shí)，由于3'末端核苷酸是經(jīng)過2'，3' -雙脫氧修飾的，因此下 一個(gè)dNTP原料由于無法與該3'末端核苷酸正常形成3'，5' -磷酸二酯鍵，因而無法添加 上去，即該條引物被"封閉"，無法順利進(jìn)行延伸，因此最終結(jié)果是無法擴(kuò)增出包含SNP位點(diǎn) 的目的片段。凝膠電泳分離后的結(jié)果為無目的擴(kuò)增條帶；而當(dāng)待測的DNA樣品基因型為突 變型時(shí)，由于在SNP位點(diǎn)處，堿基序列發(fā)生了改變（置換、增添或缺失），導(dǎo)致該雙脫氧修飾 引物的3'末端與此模板無法互補(bǔ)配對，即形成了錯(cuò)配，這樣在PCR反應(yīng)體系中高保真DNA 聚合酶3'，5' -核酸外切酶活性的作用下，該3'末端包括雙脫氧修飾的核苷酸在內(nèi)的錯(cuò)配 的幾個(gè)核苷酸就會(huì)被逐個(gè)切除下來，直至引物剩余的若干寡核苷酸可以和模板序列完全互 補(bǔ)配對為止。由此，經(jīng)過切除后形成的新的3'末端便是正常的核苷酸，解除了 2'，3' -雙 脫氧修飾的"封閉"作用，因此在Taq DNA聚合酶的作用下可以順利延伸，最終與另一條引 物一起，經(jīng)過PCR反應(yīng)可以擴(kuò)增得到一條覆蓋SNP位點(diǎn)的大小約200bp~500bp的目的片 段。經(jīng)凝膠電泳分離后，可得到一條清晰的條帶，與之前描述的基因型為野生型的DNA樣品 PCR反應(yīng)后的凝膠電泳分離結(jié)果形成了鮮明對比。由此而達(dá)到檢測待測DNA樣品SNP的目 的（如圖1)。
[0067] 本發(fā)明所述的PCR反應(yīng)，其體系中具體包括：PCR反應(yīng)緩沖液（由高保真DNA聚合 酶與非高保真DNA聚合酶各自對應(yīng)的反應(yīng)緩沖液組成）、dNTP、待測DNA樣品、上/下游引 物、Taq DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、滅菌去離子水。一種情況下，當(dāng)SNP位點(diǎn)堿基與雙 脫氧修飾引物的3'末端的相應(yīng)堿基序列相同時(shí)，則該引物為上游引物（辨別性引物），普通 引物為下游引物；當(dāng)與之互補(bǔ)時(shí)，則該雙脫氧修飾引物為下游引物（辨別性引物），普通引 物為上游引物。而對于Taq DNA聚合酶，主要利用的是其DNA聚合活性（引物延伸活性）； 對于高保真DNA聚合酶，則主要利用的是其3'，5'_核酸外切酶活性（校對功能）。反應(yīng)所 用到的PCR儀為常規(guī)PCR儀。
[0068] 正是由于SNP的檢測與區(qū)分是以引物的延伸/不延伸作為判斷依據(jù)的，而引物的 延伸與否，又嚴(yán)格取決于3'末端是否被2'，3' -雙脫氧修飾的核苷酸所"封閉"，亦即3'末 端序列是否與相應(yīng)的模板序列完全互補(bǔ)配對，因此這種延伸或者不延伸是絕對的，著名的 測序方法--Sanger雙脫氧終止法也正是利用了當(dāng)3'末端為2'，3' -雙脫氧修飾核苷酸 時(shí)，引物便無法正常延伸這一原理的。這樣，與傳統(tǒng)的SNP檢測方法--等位基因特異性引 物延伸法相比，該發(fā)明從理論上避免了假陽性的產(chǎn)生。很大程度上提高了檢測的準(zhǔn)確度、重 現(xiàn)性。
[0069] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，本發(fā)明的方法的操作步驟如下：
[0070] 第一步，確定要研究的基因與SNP位點(diǎn)，并明確SNP位點(diǎn)突變前后的序列，即具體 的突變情況。
[0071] 第二步，根據(jù)SNP位點(diǎn)突變前的序列，也就是原野生型等位基因序列設(shè)計(jì)兩條引 物，并使其中一條引物自3'末端起的幾個(gè)堿基（不超過6個(gè)）完全覆蓋SNP位點(diǎn)，最好是 3'末端恰好位于SNP位點(diǎn)處。另一條引物在其下游（或上游），使這一對引物擴(kuò)增的目的 片段大小為200bp~500bp。對于突變類型為數(shù)個(gè)堿基的置換、增添或缺失時(shí)，這數(shù)個(gè)堿基 在設(shè)計(jì)引物時(shí)當(dāng)作一個(gè)堿基對待。
[0072] 第三步，引物合成。并對覆蓋SNP位點(diǎn)的那條引物的3'末端核苷酸進(jìn)行2'，3'_雙 脫氧修飾，但最好是進(jìn)行2'，3' -ddC的修飾。因?yàn)槟壳爸挥?' -2'，3' -ddC的修飾技術(shù)已 經(jīng)成熟，可通過許多生物試劑公司來合成（修飾），如TakaRa、Invitrogen、Qiagen、上海生 工等。其余三種雙脫氧核苷酸修飾技術(shù)目前還不很成熟，沒有現(xiàn)成的商業(yè)化渠道可供選擇。 因此需要操作者（實(shí)驗(yàn)室）自己進(jìn)行合成（修飾）。合成（修飾）方法大致為：首先按前兩 步所述設(shè)計(jì)好兩條引物并進(jìn)行常規(guī)合成，對于欲進(jìn)行修飾的那條引物，只合成除3'末端雙 脫氧核苷酸的剩余部分。例如，合成了兩條引物，長度分別為25nt與28nt，并準(zhǔn)備對28nt 的那條引物的3'末端腺嘌呤脫氧核苷酸進(jìn)行雙脫氧修飾，則合成時(shí)只合成該條引物從5' 末端起的27個(gè)寡核苷酸。合成之后，以這27個(gè)寡聚核苷酸為引物，設(shè)計(jì)引物時(shí)依據(jù)的DNA 為模板，2'，3' -ddA為原料進(jìn)行PCR反應(yīng)，由于在Taq DNA聚合酶作用下，該條引物會(huì)順利 延伸，這樣便在其3'末端添加上了一個(gè)2'，3' -ddA，正由于當(dāng)3'末端為2'，3' -雙脫氧核 苷酸時(shí)引物是無法再繼續(xù)延伸的，因此加上去一個(gè)2'，3' -ddA后，PCR反應(yīng)即終止。之后 再通過凝膠電泳將該條引物從PCR反應(yīng)體系中分離純化出來，即得到了最終需要的28nt的 2'，3' -雙脫氧修飾引物。此方法類似于Sanger雙脫氧終止測序法的原理。
[0073] 第四步，PCR反應(yīng)。按照前述內(nèi)容配制PCR反應(yīng)體系（20uL或50uL均可），其中 Taq DNA聚合酶用量建議為0.5U-1U，高保真DNA聚合酶（以TaKaRa Prime如I. |; HS DNA Polymerase為例）用量為0. 1U-0. 5U (20uL體系）。其余試劑或原料均按常規(guī)PCR反應(yīng)體 系添加。PCR反應(yīng)程序?yàn)槌Ｒ?guī)反應(yīng)程序，退火溫度可根據(jù)設(shè)計(jì)的引物情況自行摸索、設(shè)定。 或根據(jù)所用的Taq DNA聚合酶反應(yīng)所需的環(huán)境條件自行優(yōu)化反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。反應(yīng)在 常規(guī)PCR儀中進(jìn)行即可。
[0074] 第四步，瓊脂糖凝膠電泳（或聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離。
[0075] 第五步，根據(jù)電泳分離后的結(jié)果，即可判斷待測DNA樣品的SNP基因型：若分離后 無條帶，則待測DNA樣品（等位基因）的基因型為野生型；若分離后有一條大小為200bp~ 500bp的條帶，則待測DNA樣品（等位基因）的基因型為突變型，即該基因待研究的SNP位 點(diǎn)處序列發(fā)生了突變。
[0076] 本發(fā)明所述的方法適用于檢測突變類型為少數(shù)（1~8個(gè)）核苷酸的置換、增添或 缺失的SNP位點(diǎn)，尤其適用于不超過5個(gè)核苷酸的置換、增添或缺失的SNP檢測。對于檢測 大片段的增添、缺失、重排等，不適合用本方法。
[0077] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所涉及的專業(yè)術(shù)語、縮略語及科學(xué)用語 等與本領(lǐng)域操作人員所熟知的含義相同。
[0078] 應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，以下所述的實(shí)施例以及所用到的儀器、試劑、材料等僅是作為示 范，旨在進(jìn)一步闡述本發(fā)明方法的實(shí)用性與可操作性。實(shí)際操作中所用到的儀器、試劑、材 料以及反應(yīng)條件等，并不局限于文中所述。具體操作時(shí)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的條件、需要、目的以 及制造商的要求與建議自行選擇儀器、試劑、材料等，自行設(shè)計(jì)、安排實(shí)驗(yàn)。只要實(shí)施方案與 以下所述內(nèi)容類似或均等即可。
[0079] 標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA樣品及臨床待測DNA樣品
[0080] 以下實(shí)施例中所用到的標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA樣品均使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit (大連TaKaRa公司）提取自人肺癌A549細(xì)胞株。
[0081] 試劑及儀器
[0082] 以下實(shí)施例中所用到的（IOX)PCR反應(yīng)緩沖液、（5X)PCR高保真酶反應(yīng)緩