高親和力Matriptase抑制劑的制作方法
【專利說明】高親和力Matr i ptase抑制劑
[0001] 本發(fā)明涉及胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶matriptase的新穎的高度有效的肽抑制 劑。本發(fā)明的優(yōu)選分子SDMI-I和2是藥學相關蛋白酶matriptase在近生理pH的有效抑 制劑，并且因此，可應用于治療或診斷中。
[0002] 胰蛋白酶是脊椎動物的小腸中廣泛存在的最主要的消化酶之一。[1]其有趣的分 子構架包括著名的催化三聯(lián)體Asp-His-Ser作為執(zhí)行其蛋白水解活性的核心特征。[2]該 原型結構和切割堿性殘基之后的肽鍵的能力構成被稱為胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的生物 催化劑的整個類別的結構和功能基礎。[3]該酶家族的成員參與多種生物過程，并且以可溶 形式或作為膜錨定實體存在。[4]11型跨膜絲氨酸蛋白酶（TTSP)，例如，經由N-末端結合 至細胞表面，并且已經表征為各種效應分子的細胞外周加工和活化的重要介體。[3-5]通過 由特定TTSP的內切蛋白水解切割從非活性前體生成肽激素、生長和分化因子、受體、酶和 粘附分子的活性形式。[4]因此，它們在細胞發(fā)育和維持體內穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用。[3]。
[0003] 與藥物相關的膜錨定的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的充分研宄的實例是 matriptase。[6]它在健康組織中的上皮細胞的表面上廣泛表達，其中其蛋白水解活性受天 然蛋白酶抑制劑如肝細胞生長因子抑制劑-1和2(ΗΑΙ-1，ΗΑΙ-2)精確調節(jié)。[6c，6f]然而， 該生理抑制劑-蛋白酶平衡的失調據(jù)信促進病理過程。實際上，許多研宄將matriptase過 表達與上皮腫瘤的發(fā)生和進展以及骨關節(jié)炎和動脈粥樣硬化相關聯(lián)。[6g-k]此外，Napp等 人觀察到鼠原位胰腺腫瘤（orthotopic pancreatic tumor)模型中的明顯體內matriptase 活性，并且顯示活性位點抑制劑的施用顯著降低底物分析物的蛋白水解。[6d]因此，有效且 選擇性的matriptase抑制劑具有很大的治療重要性，并且其開發(fā)是一項具有挑戰(zhàn)性的任 務。迄今為止，已經報道了表現(xiàn)出個位數(shù)納摩爾至亞納摩爾抑制常數(shù)的許多小的合成有機 化合物以及大的抗體片段。[7]。
[0004] 本發(fā)明人使用向日葵胰蛋白酶抑制劑-I (SFTI-I)的剛性且良好定義的十四肽構 架作為結構導向的先導化合物優(yōu)化的起點。該分子支架具有抗蛋白水解活性的典型（底 物模擬）環(huán)，并且已經被成功地用于生成糜蛋白酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、β-類胰蛋 白酶、蛋白酶K或激肽釋放酶相關的肽酶的抑制劑。[10]此外，在TTSP的pH最佳值（pH ~8. 5-9)對于雙環(huán)肽已經報道了納摩爾范圍（Ji = 1-150 nM)的針對matriptase的潛在 抑制活性。[11]最近，我們顯示，該中等功效在具有近生理參數(shù)Ori = 1.1 μΜ，在pH 7.6) 的環(huán)境中基本上降低。這對于潛在的體內應用特別重要。治療/診斷劑必須在體內穩(wěn)態(tài)下 或一在腫瘤以及炎癥誘導的低氧的情況下一更酸性的條件下具有高活性。[12]。
[0005] 使用結構導向的增量優(yōu)化策略，我們能夠生成具有個位數(shù)納摩爾Ki以及具有改 善的胰蛋白酶/matriptase選擇性概況的SFTI-I衍生物。
[0006] 最有利的氨基酸取代和隨后的C-末端截短的組合得到SFTI-I衍生的matriptase 抑制劑-1和2 (SDMI-1和2)，其具有低納摩爾至個位數(shù)納摩爾范圍的抑制常數(shù)。初始肽/ 擬肽文庫的結構導向的設計以及氨基酸序列的縮短通過在計算機芯片上實驗而啟發(fā)，所述 計算機芯片上實驗用作朝向野生型化合物的有益修飾的想法源泉。[6e]因此，開發(fā)具有僅 十二個殘基以及有利于后者酶的反向胰蛋白酶-matriptase選擇性的抑制劑。
[0007] 雖然使用"銅點擊（copper-click) "化學的應用合成策略可適用于大多數(shù)含有三 唑基的擬肽1-16的組裝，但它與在位置10使用非天然氨基酸疊氮基丙氨酸不相容（化合 物9、11、13和15)。在我們先前的工作中，我們沒有觀察到使用Fmoc-Aza-OH作為微波輔助 的Fmoc-SPPS的結構單元（building block)的顯著限制。[15]然而，通過修改的合成路線 規(guī)避了在所述條件下未受保護的疊氮化物官能團（functionality)的意料之外的限制適 用性。
[0008] 包含SFTI-I [7, 74衍生物1 一 22的小化合物文庫的設計和合成：
[0009] 包含SFTI-I [7, 74衍生物1 一 22的小化合物文庫的設計和合成。A)收集含有 三唑基的肽1 一 16以及在位置10和12具有使用典型氨基酸賴氨酸、精氨酸、丙氨酸、纈氨 酸、異亮氨酸或組氨酸的單取代的變體17 - 22。B)前體23、24、25和26以及抑制劑17 - 22的合成。C)和D)得到含有三唑基的肽1 一 16的合成途徑的示意圖。條件：a)微波輔 助的Fmoc-SPPS ;b)使用 TFA/H20/苯甲醚/TES (47:1:1:1，v:v:v:v)和二硫蘇糖醇（DTT) 從固體支持物酸解切割，c)以I mg肽/mL在100 mM (順4)20)3水溶液（aq) (ρΗ=8· 4)中的 空氣介導的氧化大環(huán)化（oxidative macrocyclization) ;d)在環(huán)境溫度使用DMF中的給 定炔組分（5當量（eq))、CuS04*5H20 (20 mol %)、抗壞血酸鈉（20 mol %)和％，二異丙 基乙胺（DIEA，8當量）的樹脂上（on-resin) CuAAC(過夜），e)以I mg肽/mL在100 mM (NH4)2CO3水溶液（pH=7. 7)中的空氣介導的氧化大環(huán)化。所有化合物1 一 22都通過制備型 反相HPLC分離。
[0010] 以下化合物代表本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，其中化合物43和44是最優(yōu)選的。
[0011] 序列 SFTI-IU 74 (野生型）
在位置7 (Rl)UO (R2)和12 (R3)的取代
[0012] 新穎化合物43和44是在近生理pH的pH范圍中matriptase的令人驚訝地有效 的抑制劑，并且因此，可應用于治療或診斷中。
[0013] 因此，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是式I的化合物
式⑴ 其中 R1 表示 A 或（CH2)nHet, R2 表示 A、（CH2)nHet 或（CH2)3NHC (=NH) NH2， R3 表示 A、（CH2)nHet 或（CH2)nAr, A表示具有1、2、3、4、5或6個C-原子的直鏈或支鏈烷基， Ar表示苯基， He t表示呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、異噁唑基、噁二唑基 (oxadiazolyl)、噻唑基、三唑基或四唑基，其每一個未取代或被（CH2)nNH 2、C00H、C00A或Ar 單取代， η表示0、1、2或3， 和其藥學上可接受的溶劑合物、鹽、互變異構體和立體異構體，包括其所有比率的混合 物。
[0014] 特別優(yōu)選的實施方案是式1的化合物，其中 Het表示三唑基或咪唑基，其是未取代的或被（CH2) nNH2、C00H、COOA或Ar單取代，和其 藥學上可接受的溶劑合物、鹽、互變異構體和立體異構體，包括其所有比率的混合物。
[0015] 進一步實施方案是根據(jù)式（I)的化合物， 其在位置Rp馬和/或R 3具有非天然存在的取代。
[0016] 一個特別優(yōu)選的實施方案是根據(jù)式1的突變的SFTI，其中RpRjP/或R3選自 C1-Cjg級烷基或芳基烷基。
[0017] 優(yōu)選的是以下化合物，特別是42、43和44,且最好的實施方案是43和44。
[0018] 這些化合物可用于包含本發(fā)明的突變的SFTI和藥學上可接受的賦形劑的藥物組 合物。
[0019] 此類藥物組合物可用于治療癌癥。
[0020] 此類藥物組合物的進一步優(yōu)選的用途包括治療matriptase蛋白酶功能障礙相關 的疾病，其中所述疾病選自癌癥、慢性阻塞性肺疾病、外周或中樞神經系統(tǒng)的病癥或心血管 病癥，由此matriptase功能障礙相關的疾病的癥狀得到減輕。
[0021] 步驟1 :調整單數(shù)殘基的親和力（增量） 胰蛋白酶和matriptase共享非常相似的底物譜。因此，我們推理SFTI-I [7, 74的典 型區(qū)域內的取代對于改善的親和力是不利的。然而，在我們的分子設計中，我們包括P2M立 置（Ile7)作為側鏈替代的位點。Matriptase的組氨酸40和143與該殘基密切靠近，因此 它們可能提供與配體的有利的氫鍵鍵合相互作用的可能性。
[0022] 為了降低合成費用且覆蓋足夠的結構和功能空間，我們設置了不同的合成程序。 使用市售的結構單元Fmoc-L-疊氮基丙氨酸（Fmoc-Aza-OH)和Fmoc-L-疊氮基高丙氨酸 (Fmoc-Aha-OH)將攜帶疊氮化物的肽支架23和24組裝在固體支持物上。用不同的炔組 分的樹脂上銅（I)-催化的疊氮化物-炔環(huán)加成（CuAAC)允許方便安裝胺、羧酸、相應的甲 酯和位置7的苯基官能團。該組合方法與Burk和同事先前描述的"拴系片段（tethered fragment)"策略相當類似。[13]從固體支持物的酸解切割、氧化大環(huán)化和層析分離得到 SFTI-I [7, 74衍生物1 一 8。有趣地，通過選擇大環(huán)化條件，游離羧酸3和4以及相應的甲 酯5和6可從各自的開鏈甲酯前體肽選擇性獲得。在pH 8.4形成二硫鍵過程中水解羧酸 甲酯，得到游離酸3和4。然而，將pH設定至7. 7允許保留甲酯基團，得到相應的胱氨酸橋 聯(lián)的（cystine-bridged) 5 和 60
[0023] 不幸地，位置7變體1 一 8無一在酶抑制測定中顯示相對于SFTI-I [7, 74改善的 matriptase親和力（表1)。因此，我們將我們的進一步實驗集中于位置10和12的優(yōu)