化。
[0024] 在配體-受體復(fù)合物中,SFTI-I [7, 74的殘基10的側(cè)鏈朝向matriptase的具有 明顯負極化的表面積。Asp96的β-羧基對該環(huán)境有顯著貢獻。Yuan等人建議在抑制劑的 位置10安裝具有低構(gòu)象自由度的短堿性側(cè)鏈官能團,如氨基丙氨酸或氨基高丙氨酸以建 立有利的靜電相互作用。[66]盡管如此,初始分子建模暗示,在晶體結(jié)構(gòu)(PDB-ID:3P8F)中 存在的其天然構(gòu)象中與Asp96的β-羧基接近的堿性官能團位置需要約四至五個亞甲基單 元的接頭。因此,我們設(shè)計了具有適當長度的平面和剛性三唑基接頭的SFTI-1[7, 74衍生 物9 - 16以研宄配體和受體之間新的有利相互作用的可能性。
[0025] 最初,設(shè)計9 一 16的合成途徑作為用于SFTI-I [7, 74變體1 一 8的方法的改良 方案。盡管變體10、12、14和16容易通過該策略獲得,但以該方式無法合成化合物9、11、13 和15。在固體支持物上組裝肽-樹脂25的AzalO類似物的嘗試導(dǎo)致副產(chǎn)物的不確定的混 合物(數(shù)據(jù)未顯示)。盡管如此,我們能夠經(jīng)由如中描繪的樹脂結(jié)合的五肽中間體26合成 化合物9、11、12和15。
[0026] 有趣地,對于八種含有三唑基的擬肽9 一 16中的四種觀察到相對于SFTI_1[7, 74 的matriptase親和力的顯著增加(表1)。對于氨基甲基-官能化的1,2, 3-三挫9檢測 到抑制劑9、10、13和15的集合內(nèi)的最明顯增強?;衔?和SFTI-I [7, 74之間的結(jié)合/ 解離的自由能的差異ΔΒ6被計算為3.9 kj/mol。因此,通過提供在位置10的具有堿性官 能團的肽成功地建立額外的有利的靜電抑制劑-酶相互作用。然而,如果三唑基接頭的長 度僅增加一個亞甲基單元(10),則顯著降低了有吸引力的貢獻。此外,在該位置安裝酸性羧 基(11,12)對于matriptase抑制是有害的。值得注意的是,對于正式不帶電荷的甲醋衍 生物13還觀察到與SFTI-I [7, 74相比抑制劑功效的顯著增加,盡管沒有像氨基官能化變 體9的情況下那么明顯。
[0027] 此外,我們研宄了 matriptase親和力中在位置10(17,18)的基本典型的氨基酸 賴氨酸和精氨酸的影響。令人驚訝地,配備柔性脂族接頭的化合物18表明表1中列出的 SFTI-I [7, 74變體1-22的最高功效。由于各自的氨基酸側(cè)鏈固有的構(gòu)象自由度,對于化合 物17和18已經(jīng)預(yù)期明顯熵罰分。[6e]事實上,ε-氨基官能化衍生物17比具有相當長度 的更剛性和限制的接頭基序的抑制劑9效力略低。然而,對應(yīng)于Ab功曾加6.5 kj/mol的 兩位數(shù)納摩爾表由單一氨基酸取代導(dǎo)致(18)。
[0028] 最后,我們研宄matriptase親和力中SFTI-IU 74構(gòu)架的位置12的修飾的影 響。Yuan等人描述了由于由Phe97和Phe99側(cè)鏈引起的構(gòu)象限制(形成酶的S4亞位點) 導(dǎo)致的對SFTI-I的Phel2的明顯不期望的熵效果(圖1D)。[6d因此,具有較大芳族側(cè)鏈 的非天然氨基酸對Phel2的取代對生物活性具有不利影響。[llb]因此,我們決定用較小脂 族、疏水以及雜芳族氨基酸丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和組氨酸取代天然苯丙氨酸殘基(圖 2A)。各自的化合物19 一 22通過常規(guī)微波輔助的Fmoc-SPPS和隨后氧化大環(huán)化和層析分 離來合成(參見支持信息)。
[0029] 事實上,我們在我們的體外測定中觀察到Phel2Ile (21)以及Phel2His (22)取 代對matriptase抑制的有益效果。具體而言,在位置12(22)的咪唑官能團促進了 SFTI-I 構(gòu)架和酶的表面之間約3 kj/mol的改善的相互作用。
[0030] 步驟2 :有利的增量修飾的組合 受對于化合物9、18和22觀察到的增強的matriptase親和力鼓勵,我們將位置10的單 一修飾(9,18)與所述Phel2His取代(22)組合。經(jīng)由微波輔助的Fmoc-SPPS (42)或通過 使用與對于化合物9 一 16 (42)所述的策略類似的策略合成所得構(gòu)建體42和43。抑制劑 42和43表現(xiàn)出與SFTI-I [7, 74衍生物9、18和22相比進一步增加的matriptase親和力 (表2)。我們的計算表明,Ab郵]觀察到的改善主要依賴于累加效果?;衔?8和22的 測定的個別有利的貢獻總計為9.6 ± 0.6 kJ/mol,然而43和SFTI-1[7, 74之間的結(jié)合/ 解離的自由能的差異被計算為10.3 ± 0.4 kj/mol。這兩個值之間的差異可以對協(xié)同行為 作出解釋。[14]然而,考慮到各自的估算的不確定性,觀察到的效果是可忽略的。在抑制劑42 的情況下,對于安裝的修飾檢測到甚至不利的非累加部分,因為的計算增加比增量改 善的總和更?。ū?)。盡管如此,我們稱為SFTI-I衍生的matriptase抑制劑-I (SDMI-I) 的十四肽43在接近生理pH具有11 nM的低抑制常數(shù)。此外,在接近matriptase的pH最 佳值(pH = 8. 5)進行的酶測定中,觀察到單位數(shù)納摩爾表(I. I nM)。
[0031] 步驟3 :最有希望變體的截短 在最近研宄中,我們在計算機芯片上進行幾種單環(huán)三唑橋聯(lián)的SFTI-I衍生物的結(jié)構(gòu) 分析。得到的結(jié)果表明末端區(qū)域?qū)atriptase親和力的顯著影響。在呈現(xiàn)的工作中已經(jīng) 描述和解決了通過酶的芳香側(cè)鏈的母體雙環(huán)肽的Phel2殘基的固定引起的熵罰分。Μ然 而,形成二級環(huán)的殘基Prol3和AspH的額外構(gòu)象限制在結(jié)合至matriptase之后可引起 不利的熵貢獻。根據(jù)我們的計算,與胰蛋白酶的相互作用不以該方式受影響。因此,兩個 C-末端殘基的截短可對matriptase抑制具有有益效果。此外,我們推理,通過引入C-末 端酰胺去除末端羧基的負電荷可以增強目標酶和抑制劑之間的總體電荷互補性。受這些 考慮啟發(fā),我們合成了單環(huán)十二肽44,如實驗部分(方案1)中所述。事實上,我們觀察到 抑制劑功效的額外輕微改善,導(dǎo)致6.2 ± 1.2恤的Ki。該SFTI-I衍生的matriptase抑 制劑-2(SDMI-2)在pH 8. 5表現(xiàn)出2. 3 ± 0. 8 nM抑制常數(shù),并且顯示相對于胰蛋白酶 朝向matriptase改善的選擇性(6倍)。據(jù)我們所知,43和44是迄今為止描述的最有效 Bowmann-Birk matriptase抑制劑,其表明與報道的小有機化合物相當?shù)囊种苹钚浴7a]。
[0032] 最后,我們基于上述SFTI-I [7, 74和matriptase的計算機芯片上坐標建模 SDMI-2 (44)的抑制劑-蛋白酶復(fù)合物(參見圖1)。[參考文獻]首先,將氨基酸交換 IlelOArg和Phel2His引入親本模型。然后,C-末端酰胺替代殘基Pr〇13和Aspl4。側(cè)鏈幾 何學(xué)和隨后的能量最小化的優(yōu)化得到與相應(yīng)SFTI-I共晶體相當類似的結(jié)構(gòu)(3P8F,圖3A)。 盡管如此,觀察到44和matriptase之間的額外有利的相互作用(圖3B)。將Asp96的側(cè) 鏈重新定向,以便與ArglO的胍基官能團形成雙凹(bi-dented)氫鍵。此外,檢測到Asp96 的骨架羰基氧和Hisl2的ε2-氮之間的質(zhì)子供體-受體相互作用的可能性。然而,需要 SDMI-2-matriptase復(fù)合物的X射線結(jié)構(gòu)來無疑證明預(yù)測的計算機芯片上坐標是否是有效 的。Yuan等人建議在位置10使用短堿性氨基酸如氨基高丙氨酸以建立與Asp96的有效的 靜電相互作用,同時減輕由延伸的柔性接頭產(chǎn)生的熵罰分。Μ然而,仍然待檢驗此類短側(cè) 鏈是否足以將堿性官能團置于Asp96的羧基的接近處。
[0033] 導(dǎo)致本發(fā)明的實驗中使用的所有化學(xué)品和溶劑購自Bachem、Iris Biotech、 Novabiochem、Sigma-Aldrich、Rapp Polymere、Roth 或 Varian (Agilant)0
[0034] 分別在Varian 920-LC系統(tǒng)和Varian 940-LC系統(tǒng)上進行分析型和半制備型 RP-HPLC。Phenomenex Hypersil 5u BDS C18 LC 柱(150 X 4.6 mm, 5 μπι, 130 A)和 Phenomenex Luna 5u C18 LC柱(250 X 12. 20 mm, 5 μm, 100 A)用作固定相。洗脫液系 統(tǒng)由洗脫液A (0. 1 % TFA水溶液)和洗脫液B (含有0. 1% TFA的90 %乙腈水溶液)組成。
[0035] 用 Shimadzu LCMS-2020 使用 Phenomenex Jupiter 5u C4 LC 柱(50 X I mm, 5 μ m,300 A)以及由洗脫液A (0. 1%甲酸水溶液,LC-MS級)和洗脫液B (含有0.1 %甲酸 的100 %乙腈,LC-MS級)組成的二兀洗脫液系統(tǒng)記錄ESI質(zhì)譜。
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[0038] 圖2顯示d)在環(huán)境溫度使用DMF中的給定炔組分(5當量)XuSO4 · 5H20 (20 mol %)、抗壞血酸鈉(20 mol %)和二異丙基乙胺(DIEA,8當量)的樹脂上CuAAC (過夜); b)使用TFA/H20/苯甲醚/TES (47:1:1:1,V:V:V:V)和二硫蘇糖醇(DTT)從固體支持物酸 解切割,c)以I mg肽/mL在100 mM (NH4)2CO3水溶液(pH=8. 4)中的空氣介導(dǎo)的氧化大環(huán) 化,e)以I mg肽/mL在100 mM (NH4)2CO3水溶液(ρΗ=7· 7)中的空氣介導(dǎo)的氧化大環(huán)化。
[0039] 圖3顯示a)微波輔助的Fmoc-SPPS。支架