一個(gè)葉綠體發(fā)育必需的蛋白質(zhì)及其基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一種利用圖位克隆技術(shù)克 隆水稻ALl基因（其編碼蛋白質(zhì)為水稻葉綠體核糖體大亞基蛋白L12,簡(jiǎn)稱PRPL12)以及利 用轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)鑒定該基因的功能，同時(shí)利用該基因調(diào)節(jié)葉綠體發(fā)育，應(yīng)用于雜交水稻制種 中。
【背景技術(shù)】
[0002] 高等植物的葉綠體發(fā)育是和其葉片發(fā)育緊密相關(guān)的。葉綠體的形成需要質(zhì)體和核 基因組協(xié)調(diào)控制，且絕大部分是受到核基因調(diào)控，約95%的質(zhì)體蛋白質(zhì)是核基因編碼的。葉 綠體發(fā)育過(guò)程中的任何突變通常都會(huì)導(dǎo)致葉色突變。研宄水稻苗期白化致死突變可以幫助 深入了解葉綠體發(fā)育的機(jī)制，同時(shí)白化致死基因可以應(yīng)用于水稻制種工作中，提高制種質(zhì) 量，保護(hù)種子生產(chǎn)者的合法權(quán)益。
[0003] 葉綠體發(fā)育及葉片生長(zhǎng)可以分為三個(gè)步驟：第一步是質(zhì)體的復(fù)制和質(zhì)體DNA合成 的激活；第二步是葉綠體建成階段；第三步是光合器官高豐度的合成。在葉綠體建成階段 葉綠體轉(zhuǎn)錄和翻譯器官的形成需要大量質(zhì)體核糖體蛋白。非必需質(zhì)體核糖體蛋白突變會(huì)導(dǎo) 致葉綠素合成缺失，而必需質(zhì)體核糖體蛋白的突變會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞的死亡。
[0004] 植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在三類核糖體，即在細(xì)胞質(zhì)中、線粒體中和葉綠體中，其中葉綠 體核糖體蛋白組成已經(jīng)全部被鑒定出來(lái)，但是其具體功能還不清楚。擬南芥葉綠體核糖 體L21在編碼區(qū)的一個(gè)單堿基變異導(dǎo)致類囊體膜和葉綠體不能正常形成（Yin等，Planta， 2012, 235:907-921)。水稻質(zhì)體核糖體蛋白的S20、L13和L21的突變體也都表現(xiàn)出相似的白 化表型，但還不知道它們具體的產(chǎn)生機(jī)制（Gong等，G3, 2013, 3:1769-1777 ;Song等，Plant Mol Biol，2014,84:301-314;Lin 等，Plant Biology，2014,17:599-607)。但總的來(lái)說(shuō)，植 物質(zhì)體核糖體蛋白的克隆及生物學(xué)功能的研宄還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠深入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種從水稻幼苗完全白化突變體中克隆的新基因 ALl，該基因編碼一個(gè)葉綠體核糖體大亞基蛋白（PRPL12)，是葉綠體發(fā)育必需蛋白質(zhì)。
[0006] 本發(fā)明提供了一種葉綠體發(fā)育所必需的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID No. 2(即序 列表中的序列2)所示的氨基酸序列，且由基因 ALl編碼。
[0007] 作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)的改進(jìn)：氨基酸序列還包括在SEQ ID No. 2所述的氨基酸序 列中添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸生成的衍生物。
[0008] 本發(fā)明同時(shí)還提供編碼上述蛋白質(zhì)的基因，例如其具有SEQ ID No. 1 (即序列表中 的序列1)所示的核苷酸序列。
[0009] 作為本發(fā)明的基因的改進(jìn)：核苷酸序列還包括在SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列 中添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸而生成的突變體、等位基因和衍生物。本發(fā)明 還提供了含有上述的葉綠體發(fā)育所必需的蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0010] 含有上述的葉綠體發(fā)育所必需的蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)基因重組菌。
[0011] 本發(fā)明同時(shí)還提供了上述基因的用途：用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻。具體是在培育導(dǎo)致 葉綠體發(fā)育受阻，苗期白化致死的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明同時(shí)還提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，為包含本發(fā)明所述基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì) 胞。
[0013] 本發(fā)明的具體實(shí)施步驟如下：
[0014] -、水稻幼苗完全白化突變體all的分離和表型分析
[0015] 本研宄水稻突變體all，其在田間表型的主要特征是：從種子萌發(fā)至三葉期幼苗 表現(xiàn)為完全白化，三葉期后隨著種子養(yǎng)分耗盡，白化幼苗逐漸干枯死亡（圖1)。葉綠素測(cè) 定結(jié)果顯示突變體all的幼苗的葉綠素含量顯著低于野生型（圖2)。利用透射電鏡（TEM) 觀察野生型和all的幼苗二葉期葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)野生型的葉綠體含有正常的片 層結(jié)構(gòu)，而all葉肉細(xì)胞中僅含有類似于空泡的囊狀結(jié)構(gòu)（圖3)。
[0016] 二、水稻ALl基因的遺傳分析及圖位克隆
[0017] 1.突變體性狀的遺傳分析
[0018] 在以日本晴為輪回親本，9311(又名揚(yáng)稻6號(hào)，江蘇省里下河地區(qū)農(nóng)科所育成品 種，品種審定編號(hào)：國(guó)審稻2001002)為供體親本的染色體片段替換系中發(fā)現(xiàn)一個(gè)株系，其 后代始終表現(xiàn)為白化苗和綠苗分離。突變體雜合株系均表現(xiàn)為正常綠色，隨機(jī)選取5個(gè)雜 合株系，其自交F2群體中正常植株與突變體植株分離比接近3:1 (表1)，表明此突變體性狀 由一對(duì)隱性核基因控制。
[0019] 表1隨機(jī)的5個(gè)F2分離群體分離比例
[0020]
[0021] Ρ<(λ Ub 農(nóng)不顯者。
[0022] 2. ALl基因的圖位克隆
[0023] 為了分離ALl基因，本發(fā)明首先建立了一個(gè)大的突變體雜合株系作為Fl代，從自 交產(chǎn)生的F2代表型分離群體中選取其中的隱性個(gè)體進(jìn)行基因定位，利用已有的均勻覆蓋 全基因組的分子標(biāo)記對(duì)ALl位點(diǎn)進(jìn)行初步定位，將其初步定位在地1染色體的長(zhǎng)臂上，介于 標(biāo)記ΙΝ105和Chr 102之間。然后通過(guò)對(duì)兩標(biāo)記之間的序列進(jìn)行分析，發(fā)展了多個(gè)新的分子 標(biāo)記，最終將ALl精細(xì)定位與標(biāo)記CAPS107和CAPS113之間約42. 2kb的范圍之內(nèi)（圖4)。 根據(jù)精細(xì)定位結(jié)果，分析發(fā)現(xiàn)在此區(qū)段內(nèi)存在7個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF2, SEQ ID No. 1)，其中 0RF2編碼一個(gè)葉綠體核糖體大亞基L12蛋白（PRPL12)。序列分析表明，突變體all中0RF2 存在一個(gè)特殊的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（single nucleotide polymorphism，SNP)，白化苗中 該SNP位點(diǎn)不同于日本晴和9311，因此0RF2(PRPL12)可能就是ALl的目的基因。
[0024] 3. ALl基因功能互補(bǔ)研宄
[0025] 為了證明0RF2(PRPPL12)就是ALl的目的基因，我們對(duì)突變體all進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因 互補(bǔ)試驗(yàn)驗(yàn)證。轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)驗(yàn)證主要是將野生型ALl基因全長(zhǎng)基因組序列克隆到雙元植 物轉(zhuǎn)基因載體PCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn)。將構(gòu)建好的重組載體pl300-ALl通過(guò)農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化突變體雜合株系愈傷，經(jīng)過(guò)抗性愈傷篩選得到轉(zhuǎn)基因苗。轉(zhuǎn)化了 ALl基因的突變體雜合株系愈傷得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系幼苗恢復(fù)正常綠色 表型，形態(tài)和正常野生型幼苗沒(méi)有差異（圖5)。轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)試驗(yàn)確證了突變體表型是由 ALl基因（0RF2, PRPL12)突變引起的，表明本發(fā)明獲得了使突變體恢復(fù)正常功能的轉(zhuǎn)基因 水稻。
[0026] 本發(fā)明利用水稻幼苗完全白化突變體，通過(guò)圖位克隆法得到ALl基因，該基因編 碼葉綠體核糖體大亞基L12蛋白（Plastid ribosome protein L12，PRPL12)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因 互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明了 ALl基因在水稻葉綠體發(fā)育形成方面扮演了必不可缺的角色。因而本發(fā)明 為完善葉綠體發(fā)育機(jī)制研宄打下了基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1是野生型日本晴和all突變體幼苗不同發(fā)育時(shí)期的表型。A為萌發(fā)初期，B為 二葉期，C為三葉期后幼苗接近干枯死亡時(shí)期。A，B，C左邊為野生型，右邊為all突變體。
[0028] 圖2是野生型與突變體all的葉綠素含量分析。A為葉綠素 a(Chla)，葉綠素 b (Chlb)及類胡蘿卜素（Car)含量比較，B為葉綠素 a與葉綠素 b含量比率（Chi a/b)。
[0029] 圖3為野生型與突變體all的葉綠體超微結(jié)構(gòu)比較分析。A-C為野生型二葉期葉 片葉肉細(xì)胞葉綠體觀察，D-E為突變體二葉期葉片葉肉細(xì)胞葉綠體觀察。
[0030] 圖4為ALl基因的圖位克隆。A為精細(xì)定位；B為區(qū)間內(nèi)存在的候選基因；C為候 選基因 ALl的基因結(jié)構(gòu)和序列分析。
[0031] 圖5是ALl基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，TO代轉(zhuǎn)基因水稻的表型；A為野生型、all突變體、 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子Cl和轉(zhuǎn)基因空載體對(duì)照的表型觀察；B為轉(zhuǎn)基因潮霉素 PCR鑒定。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 為理解本發(fā)明，下面以實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。
[0033] 實(shí)施例1 :AL1基因的克隆
[0034] L水稻材料
[0035] 水稻（Oryza sativa)突變體all (albino lethal 1)，野生型材料為粳稻品種日本 晴。
[0036] 2.電鏡觀察
[0037] 利用透射電鏡（TEM)觀察野生型和all幼苗二葉期葉片的葉綠體超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn) 野生型的葉綠體含有正常的片層結(jié)構(gòu)，而all葉肉細(xì)胞中只含有類似于前質(zhì)體結(jié)構(gòu)的囊泡 狀葉綠體（圖2)。
[0038] 3.遺傳分析和定位群體
[0039] 遺傳分析確定all為單基因隱性突變體，選取大量突變體雜合株系Fl代，自交種 植得到F2群體，從分離的F2群體中選取1417個(gè)隱性個(gè)體（完全白化苗）作為定位群體。 每株取1克左右的葉片，用于提取總DNA進(jìn)行基因定位。
[0040] 4. ALl