基因的初步定位和精細(xì)定位
[0041] 采用CTAB方法從水稻葉片中快速提取基因組DNA，用于基因定位。取大約1克水 稻葉片剪碎后放入2ml離心管，加入鋼珠經(jīng)液氮冷凍后，在磨樣機(jī)上粉碎，然后提取DNA，獲 得的DNA沉淀溶解于300微升超純水中，每個PCR反應(yīng)用1微升的DNA樣品。
[0042] 在ALl基因初步定位中，用30個隱性白化苗個體進(jìn)行分析。首先選取均勻分布于 水稻各染色體上的分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過3%瓊脂糖凝膠電泳分離，檢測條帶的多態(tài) 性，將基因初步定位到第1染色體的長臂上，介于標(biāo)記IN105和Chrl02之間（圖4)。
[0043] 然后通過分析標(biāo)記IN105和Chrl02之間的序列，發(fā)展了新的分子標(biāo)記，利用1417 個F2分離的隱性個體進(jìn)行精細(xì)定位，將ALl精細(xì)定位于標(biāo)記CAPS107和CAPS113之間約 42. 2kb的物理范圍內(nèi)（圖4)，通過分析該區(qū)段內(nèi)存在的開放閱讀框（ORF)推測候選基因， 并對這些候選基因進(jìn)行測序分析，尋找突變位點。
[0044] 新開發(fā)的分子標(biāo)記引物序列：
[0045] IN108-F(SEQ ID No. 3)5'GTCGCTGTTAGTAATCCTGC 3'
[0046] IN108-R(SEQ ID No. 4)5' CCGACCAGAATCACGC 3'
[0047] Chrll8-F(SEQ ID No. 5)5'ATCTCGGCTTCTTGCGTTCTAA 3'
[0048] Chrll8-R(SEQ ID No. 6)5' TTTCTGTTACTATAAGGAGTGGCATTC 3'
[0049] CAPS107-F(SEQ ID No. 7)5'AAGGCGTAAAGTTTCAACCG 3'
[0050] CAPS107-R(SEQ ID No. 8)5'AACGGAGTGACAGGTGGG 3'
[0051] IN110-F(SEQ ID No. 9)5'GATGCTCAAATGCTGCTGTC 3'
[0052] IN110-R(SEQ ID No. 10)5' GGGATGGCACATTATGGTAGA 3'
[0053] CAPS111-F(SEQ ID No. 11)5' TGGGATGTTGTGCTTGACTGTGG 3'
[0054] CAPS111-R(SEQ ID No. 12)5' TTTGCTATGGCGGGAGTGGAT 3'
[0055] CAPS113-F(SEQ ID No. 13)5' GCCTGTTTCTGGGCTGGATGG 3'
[0056] CAPS113-R(SEQ ID No. 14)5' CGACTGTTTCCGAACGCCAAG 3'
[0057] CAPS101-F(SEQ ID No. 15)5' TCGGTCCCTTAGCCACATT 3'
[0058] CAPS101-R(SEQ ID No. 16)5' CTGCTTCCTCCCGCCAAA 3'
[0059] IN112-F(SEQ ID No. 17)5'AACACCCATTGAGATAACACTT 3'
[0060] IN112-R(SEQ ID No. 18)5' TCACTTTCAGCCAGGAGC 3'
[0061] IN118-F(SEQ ID No. 19)5'AGGCGGTTTGAAGGATGT 3'
[0062] IN118-R(SEQ ID No. 20)5' TTTGGACGGAGGGAGTATT 3'
[0063] 5.基因預(yù)測和序列分析
[0064] 根據(jù)精細(xì)定位的結(jié)果，在42. 2kb范圍內(nèi)根據(jù)水稻基因組注釋計劃（http://rice. plantbiology. msu. edu/)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在此區(qū)間內(nèi)存在7個候選基因，我們設(shè)計了引物，采 用PCR的方法分別從日本晴、9311和all突變體基因組中擴(kuò)增出所有候選基因進(jìn)行測序分 析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中候選基因0RF2在三者間存在特殊的SNP變異。野生型親本中ALl基因序 列為SEQ ID No. 1，命名為ALl基因，其編碼的蛋白質(zhì)序列為SEQ ID No. 2。
[0065] 實施例2 :轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?br>[0066] 植物轉(zhuǎn)化：
[0067] 1.載體構(gòu)建
[0068] 將ALl基因的完整基因組序列通過酶切連接的方法將其重組到pCAMBIA1300表達(dá) 載體中（由澳大利亞CAMBIA的Jefferson教授提供，詳見www. cambia. org)，首先利用Hind III和EcoR I雙酶切pCAMBIA1300表達(dá)載體，使其線性化，在利用引物gALl通過PCR擴(kuò)增 野生型基因組DNA，電泳檢測切膠回收，同樣利用Hind III和EcoR I雙酶切將PCR產(chǎn)物重 組到PCAMBIA1300表達(dá)載體，測序確認(rèn)沒有發(fā)生堿基突變，把構(gòu)建好的載體通過電擊轉(zhuǎn)入 農(nóng)桿菌菌株中。
[0069] 擴(kuò)增ALl序列的引物序列為：
[0070] gALl-F:5'AAGCTTCCTAACACCCAGCTCCATCAGA 3'（SEQ ID No. 21)
[0071] gALl-R:5'GAATTCCACTTCAACACTACACCGCCATT 3'（SEQ ID No. 22)
[0072] 2.遺傳轉(zhuǎn)化：
[0073] (1)轉(zhuǎn)化受體的選擇
[0074] 將突變體雜合株系種子成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)基產(chǎn)生的愈傷切下， 繼續(xù)在培養(yǎng)1周，挑選生長旺盛的愈傷用于轉(zhuǎn)化的受體。
[0075] (2)遺傳轉(zhuǎn)化
[0076] 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法（Liu et al. 1998)，將pCAMBIA1300空載體和 P1300-AL1重組載體的EHA105菌株侵染水稻愈傷，共培養(yǎng)3天后，在含有潮霉素的篩選培養(yǎng) 基上培養(yǎng)。篩選到的抗性愈傷在預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天左右，將預(yù)分化的愈傷轉(zhuǎn)至分化 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，一個月左右得到抗性轉(zhuǎn)基因植株。對陽性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)表型觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)空 載體的轉(zhuǎn)基因植株依然能夠分化出完全白化的幼苗，而P1300-AL1載體陽性轉(zhuǎn)基因植株與 野生型表型一致，即all的突變表型得到了恢復(fù)（圖5)。
[0077] (3)分子檢測
[0078] 從獲得的轉(zhuǎn)化植株上剪取一小片嫩葉，微量提取DNA，利用抗性篩選基因潮霉素的 引物hyg進(jìn)行擴(kuò)增，質(zhì)粒陽性對照和轉(zhuǎn)化苗均可以擴(kuò)增出產(chǎn)物，而陰性對照無擴(kuò)增，表明轉(zhuǎn) 基因片段已經(jīng)整合到水稻基因組中（圖5)。
[0079] 綜述所述，SEQ ID No. 2為葉綠體發(fā)育所必需的蛋白質(zhì)序列，該蛋白質(zhì)在水稻葉綠 體發(fā)育及光合作用方面扮演重要作用。
[0080] 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的如干個具體實施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員從本發(fā)明公開的內(nèi)容之 間導(dǎo)出或聯(lián)想的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種葉綠體發(fā)育所必需的蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)具有SEQ ID No. 2所示的氨 基酸序列。2. -種葉綠體發(fā)育所必需的蛋白質(zhì)，其特征在于，在SEQ ID No. 2所述的氨基酸序列中 添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸或其它物種的同源序列而生成的氨基酸序列或 衍生物。3. -種編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因。4. 如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于該基因具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。5. 如權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述的核苷酸序列還包括在SEQ ID No. 1所 述的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或 衍生物。6. 含有權(quán)利要求3或4或5所述的葉綠體發(fā)育所必需的蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 系。7. 含有權(quán)利要求3或4或5所述的葉綠體發(fā)育所必需的蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)基因重組 菌。8. 權(quán)利要求3或4或5所述的葉綠體發(fā)育所必需的蛋白質(zhì)編碼基因在培育導(dǎo)致葉綠體 發(fā)育受阻，苗期白化致死的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個葉綠體發(fā)育必需的蛋白質(zhì)及其基因和應(yīng)用。該基因編碼蛋白質(zhì)是具有SEQINNO:2所示的氨基酸序列，該編碼基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。該水稻葉綠體發(fā)育必需基因發(fā)生突變可導(dǎo)致葉綠體發(fā)育受阻，幼苗即表現(xiàn)為完全白化，且在三葉期后逐漸干枯死亡。將其應(yīng)用于植物遺傳改良工作，是重要的指示基因。應(yīng)用于雜交水稻制種，可方便檢測雜交后代的純度。應(yīng)用于常規(guī)水稻制種，由于其純合致死特點，可有效防止留種以保護(hù)品種擁有者的知識產(chǎn)權(quán)。
【IPC分類】C07K14/415, C12N15/84, C12N15/29, A01H5/00, C12N1/21, C12N5/10
【公開號】CN104945491
【申請?zhí)枴緾N201510376943
【發(fā)明人】劉巧泉, 趙冬生, 張昌泉, 李錢峰, 顧銘洪
【申請人】揚(yáng)州大學(xué)
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年7月1日