溶于 IL去離子水；
[0044] I XF/2培養(yǎng)基的制備：
[0045] 天然海水經(jīng)臭氧殺菌，兩層0. 45 μ m醋酸纖維濾膜過濾，IKTC滅菌15min，冷卻后 備用；向海水中添加上述氮源母液lml/L、磷源母液lml/L、金屬元素母液lml/L及維生素母 液0. 5ml/L，制得I XF/2培養(yǎng)基。
[0046] 3XF/2培養(yǎng)基的制備：
[0047] 天然海水經(jīng)臭氧殺菌，兩層0. 45 μ m醋酸纖維濾膜過濾，IKTC滅菌15min，冷卻后 備用；向海水中添加上述氮源母液3ml/L、磷源母液3ml/L、金屬元素母液3mVL及維生素母 液I. 5ml/L，制得3XF/2培養(yǎng)基。
[0048] V .甘油母液：分析純甘油與經(jīng)0.45μπι醋酸纖維濾膜過濾的天然海水以體積比 1 :1混勻，121°c滅菌20min后冷卻，常溫保存。
[0049] 實施例3 :等鞭金藻的培養(yǎng)
[0050] 采用實施例2中的F/2培養(yǎng)基，將光密度0D_為0. 1~0. 2的等鞭金藻藻液1. 5~ 2. OL接種于3L三角瓶中，以日光燈做光源，光強為30~40 μ mol/m2 *s，培養(yǎng)2~6天至指 數(shù)生長期；離心（3000~4000rpm，3~5min)，收獲藻細胞，棄上清液，在沉淀中添加約3~ 5mL滅菌的海水，使之重新懸浮后，接種于容積為600mL的管式鼓泡反應器中，使藻液體積 為500mL，藻細胞光密度0D_為0. 28~0. 32,添加的氮源、磷源、金屬元素、微量元素分別 是實施例2所述的3XF/2培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度23~27°C，光強110~150 ymol/m2 · s，光 暗比為14h : 10h，光照階段通入含4. 0 % CO2的空氣，通氣速率0. 16~0. 24vvm，培養(yǎng)至7天 進入平衡期時，離心（4000rpm，5min)，棄上清液，沉淀用0. 5mol/L的碳酸氫按洗兩遍，60°C 烘至恒重，冷凍備用，用于測定金藻蛋白質含量并計算其產(chǎn)量。其中，
[0051] 蛋白質含量（％干重）=aXbXc/d，式中：
[0052] a:蛋白質濃度（g/L)
[0053] b :稀釋倍數(shù)；
[0054] c :樣品定容體積（mL);
[0055] d :藻泥干重（mg) X 100% ;
[0056] 蛋白質產(chǎn)量（g干重/L)=蛋白質含量X藻干重（g/L)。
[0057] 蛋白質溶液標準曲線見附圖2。
[0058] 實施例4 :補氮培養(yǎng)
[0059] 在實施例3等鞭金藻培養(yǎng)過程中，從培養(yǎng)第3天（指數(shù)生長期）起每天向500mL 培養(yǎng)液中補加〇. 5mL實施例2中所述氮源母液。
[0060] 實施例5 :添加甘油
[0061] 添加甘油的濃度：在實施例3的培養(yǎng)體系中，在培養(yǎng)第3天時分別加入3mL、8mL、 15mL、30mL、50mL、75mL、100mL實施例2中所述的甘油母液，對應培養(yǎng)體系甘油的最終濃度 分別為 41mmol/L、110mmol/L，206mmol/L、412mmol/L、686mmol/L、1030mmol/L、1372mmol/L〇
[0062] 對照組（Ommol/L):未添加甘油的實施例3中的培養(yǎng)體系。
[0063] 實施例6 :利用不同濃度甘油培養(yǎng)等鞭金藻
[0064] 按照實施例3、實施例4和實施例5的操作培養(yǎng)等鞭金藻
[0065] 添加甘油培養(yǎng)體系的藻細胞蛋白質含量和產(chǎn)量見附表1。其中甘油濃度為 412mmol/L~1372mmol/L的各培養(yǎng)體系中，藻細胞干重隨甘油濃度增加明顯下降；蛋白質 含量和產(chǎn)量先隨甘油濃度明顯增加，當甘油濃度超過1030mm〇l/L時，基本恒定不變。當甘 油濃度為686_〇1/1時，蛋白質含量和產(chǎn)量均達到最高值，分別為32%和0.56干重8/1，比 對照組的蛋白質含量和蛋白質產(chǎn)量分別提高61. 9%和86. 7%。甘油濃度從686mmol/L增 加到1372mmol/L時，等鞭金藻蛋白質含量和產(chǎn)量略有下降，但仍明顯高于對照組。因此，在 氮含量豐富的培養(yǎng)體系中，當?shù)缺藿鹪暹M入指數(shù)生長期時加入高濃度的甘油能明顯提高等 鞭金藻細胞的蛋白質含量和產(chǎn)量。
[0066] 附表1.添加不同濃度甘油條件下等鞭金藻生物量、蛋白質含量及產(chǎn)量
[0067]
【主權項】
1. 等鞭金藻的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法包括向培養(yǎng)體系中添加濃度為412~ 1372mmol/L的甘油的步驟。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所添加的甘油濃度為686~1372mmol/L。3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甘油于培養(yǎng)第3±1天添加至培養(yǎng) 體系。4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法使用的培養(yǎng)基為3 X F/2培養(yǎng)基， 通過如下方法制備： (1) 母液制備： 氮源母液：稱取75g NaNO3溶于IL去離子水； 磷源母液：稱取5g NaH2PO4 ? H2O溶于IL去離子水； 金屬元素母液：分別稱取 3. 15g FeCl3 ? 6H20, 4. 36g Na2EDTA, 0? 0098g CuSO4 ? 5H20, 0. 0063g Na2MoO4 ? 2H20, 0. 022g ZnSO4 ? 7H20, 0.0 lg CoCl2 ? 6H20, 0. 18g MnCl2 ? 4H20溶于IL去離子水； 維生素母液：〇? OOlg vitamin B12,0.2g vitamin B1,0? OOlg D-生物素，溶于 IL去離子 水； (2) 配制3XF/2培養(yǎng)基：基礎海水中添加上述氮源母液3ml/L、磷源母液3ml/L、金屬 元素母液3ml/L及維生素母液I. 5ml/L，均勻混合。5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的基礎海水是天然海水經(jīng)臭氧殺菌， 兩層0. 45 ym醋酸纖維濾膜過濾，IKTC滅菌15min，冷卻后所得。6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，在指數(shù)生長期，每24小時向培養(yǎng)體系中添 加75mg/L硝酸鈉。7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)條件包括：培養(yǎng)溫度23~27 °C，光強 110~150 y mol/m2 ? s，光暗比為14h : 10h，以通氣速率0? 1~0? 3vvm通入含4. 0 % (]〇2的 空氣。8. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，是將指數(shù)生長期的等鞭金藻按 3X IO6ceIlsAiL的密度接種于滅菌的3XF/2培養(yǎng)基；培養(yǎng)至第3±1天，向培養(yǎng)體系中加入 濃度為686~1372mmol/L的甘油；并于指數(shù)生長期，每24小時向培養(yǎng)體系中添加75mg/L 硝酸鈉；全培養(yǎng)過程設置培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度23~27°C，光強110~150 ymol/m2 *s，光 暗比為14h :10h，以通氣速率0. 1~0. 3vvm通入含4. 0% 0)2的空氣；培養(yǎng)至平衡期收獲藻 細胞； 其中，3XF/2培養(yǎng)基通過如下方法制備： a.母液制備： 氮源母液：稱取75g NaNO3溶于IL去離子水； 磷源母液：稱取5g NaH2PO4 ? H2O溶于IL去離子水； 金屬元素母液：分別稱取 3. 15g FeCl3 ? 6H20, 4. 36g Na2EDTA, 0? 0098g CuSO4 ? 5H20, 0. 0063g Na2MoO4 ? 2H20, 0. 022g ZnSO4 ? 7H20, 0.0 lg CoCl2 ? 6H20, 0. 18g MnCl2 ? 4H20溶于IL去離子水； 維生素母液：〇? OOlg vitamin B12,0.2g vitamin B1,0? OOlg D-生物素，溶于 IL去離子 水； b.配制3 X F/2培養(yǎng)基：天然海水經(jīng)臭氧殺菌，兩層0. 45 ym醋酸纖維濾膜過濾，110 °C 滅菌15min，冷卻后得基礎海水，向其中添加上述氮源母液3ml/L、磷源母液3ml/L、金屬元 素母液3ml/L及維生素母液I. 5ml/L，均勻混合制得3XF/2培養(yǎng)基。
【專利摘要】等鞭金藻的培養(yǎng)方法，所述方法包括向培養(yǎng)體系中添加濃度為412～1372mmol/L的甘油的步驟。培養(yǎng)體系中加入終濃度為412～1372mmol/L的甘油，培養(yǎng)至生長平衡期收獲藻細胞，則藻細胞蛋白質的含量和產(chǎn)量最高分別達到細胞干重的32％和0.56g干重/L，分別比對照組提高61.9％和86.7％。本方法簡單易行，為等鞭金藻細胞內(nèi)高價值蛋白質的生產(chǎn)提供了新的方法，同時為生物柴油副產(chǎn)物甘油的利用提供了新的可能途徑。
【IPC分類】C12R1/89, C12N1/12
【公開號】CN104946536
【申請?zhí)枴緾N201510282183
【發(fā)明人】楊海波, 王茜, 徐嬪, 潘彥斐, 于媛
【申請人】大連大學
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年5月28日