一種抗原特異性t淋巴細胞的分離和高效擴增培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)技術領域，涉及抗原特異性T淋巴細胞的分離和高效擴增培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是目前已知功能最強的專職抗原呈遞細胞(antigen process cells, APC)，它在誘導機體免疫應答過程中發(fā)揮重要作用。用荷載腫瘤抗原的DC作為疫苗進行免疫治療，能夠刺激機體產(chǎn)生針對腫瘤抗原的特異性細胞毒T細胞免疫應答(cytotoxic T lymphocyte, CTL)。腫瘤疫苗可分為基因修飾的樹突狀細胞疫苗、負載腫瘤抗原多肽的樹突狀細胞疫苗、轉染腫瘤抗原m R N A或R N A的樹突狀細胞疫苗、完全腫瘤細胞抗原致敏的樹突狀細胞疫苗等幾個種類，目前，負載抗原的DC疫苗在治療惡性黑色素瘤、前列腺癌、腎細胞癌的臨床試驗中已取得了較好的臨床療效。
[0003]有研宄顯示，以DC疫苗聯(lián)合過繼性T細胞免疫治療效果好，即借助于體外培養(yǎng)技術，將腫瘤抗原誘導活化的DC細胞與患者自體外周血T細胞共培養(yǎng)，然后回輸患者體內(nèi)以達到抗腫瘤的治療效果。但是，腫瘤抗原誘導活化的DC細胞與外周血T細胞共培養(yǎng)最終得到的細胞是一種異質(zhì)性的細胞群，包含活化的抗原特異性T細胞和未活化的非抗原特異性T細胞，后者占絕大多數(shù)細胞。
[0004]深圳市合一康生物科技有限公司(申請?zhí)?201410169608.7)發(fā)明的抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞的制備方法和成都百賽泰科生物技術有限公司(申請?zhí)?201410192581.3)發(fā)明的一種高效增殖、靶向殺傷腫瘤的CTL制備方法都是將DC細胞與患者自體外周血淋巴細胞共培養(yǎng)得到的異質(zhì)性的細胞群直接回輸患者體內(nèi)。這些方法得到的抗原特異性T細胞數(shù)量少，達不到很好的臨床效果，而且這些方法培養(yǎng)的T細胞容易發(fā)生已活化誘導的細胞的凋亡，限制了最終得到的T細胞的數(shù)量和活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術分離培養(yǎng)抗原特異性T細胞數(shù)量少，培養(yǎng)中T細胞容易發(fā)生發(fā)生已活化誘導的細胞凋亡的現(xiàn)象，提供了一種可提高抗原特異性T細胞數(shù)量同時減少發(fā)生已活化誘導的細胞凋亡的抗原特異性T淋巴細胞的分離和高效擴增培養(yǎng)方法。
[0006]由于腫瘤抗原誘導活化的DC細胞與外周血T細胞共培養(yǎng)最終得到的異質(zhì)性細胞群中腫瘤抗原活化的細胞毒性T淋巴細胞因具有腫瘤特異性，能直接靶向殺傷腫瘤細胞，對腫瘤細胞殺傷活性高等特點，因此是該異質(zhì)性細胞群中發(fā)揮主要抗腫瘤作用的細胞。
[0007]本發(fā)明從腫瘤抗原誘導活化的DC細胞與外周血T細胞共培養(yǎng)最終得到的異質(zhì)性細胞群中將腫瘤抗原活化的細胞毒性T淋巴細胞分離出來，并進行大量擴增，大大增加了抗原特異性T細胞的數(shù)量，并提高其殺瘤活性。
[0008]⑶137是一種T細胞活化后表達的膜蛋白，在非活化T細胞不表達，本發(fā)明將其作為分離抗原特異性T細胞的表面分子。
[0009]分離后得到的抗原特異性T細胞數(shù)量很少，本發(fā)明將其進一步高效擴增得到足夠數(shù)量的細胞用于回輸治療。培養(yǎng)中加入CD137L(CD137-配體)、IL-7，IL-15，IL-2等，⑶137-配體是⑶137的非膜結合型配體，與⑶137結合后，可誘導記憶型T細胞的形成，減少活化誘導的細胞凋亡，從而提高擴增倍數(shù)和細胞的殺傷活性；在培養(yǎng)過程中IL-7，IL-15，IL-2的組合使用比單獨使用IL-2的增殖細胞要好，且可降低IL-2的使用濃度。
[0010]本發(fā)明的具體技術方案是:步驟一:DC細胞培養(yǎng)及腫瘤抗原的負載；步驟二:抗原特異性T細胞的活化和初始擴增培養(yǎng)；步驟三:免疫磁珠法分離抗原特異性T淋巴細胞；步驟四:抗原特異性T淋巴細胞的高效擴增培養(yǎng)。
[0011]優(yōu)選的，步驟一中，所述DC細胞培養(yǎng)及腫瘤抗原的負載具體包括如下步驟:
[0012]1.1用單采機采集外周血單個核細胞，F(xiàn)icoll分離后取中間層的細胞，生理鹽水洗滌，得到PBMC (外周血單個核細胞)；
[0013]1.2取PBMC，加入(不含血清的基礎培養(yǎng)基)配成細胞懸液，接種，培養(yǎng)；
[0014]1.3培養(yǎng)2小時后晃動去除上層雜細胞，留下貼壁的單核細胞(體積比其它細胞稍大)，加入DC培養(yǎng)基，該DC培養(yǎng)基優(yōu)選的為無血清培養(yǎng)基(含10001 M/ml GM-CSF,10001 M/ml IL-4)，如MP無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)時加入2%自體血漿。
[0015]1.4第4天按照加入腫瘤抗原，腫瘤抗原可以是10 48/!111-111^/1111自體腫瘤細胞裂解物或I μ g/ml-lmg/ml全蛋白抗原；10 μ g/ml-lmg/ml抗原肽，其中抗原肽可以是一種或幾種抗原肽的混合。
[0016]1.5第5天，加入DC成熟劑(含LPS、IFN_r，終濃度分別為10ng/ml、50IM/ml)。
[0017]1.6第7天，收集細胞，并將一部分DC細胞凍存。
[0018]優(yōu)選的，步驟二中，所述抗原特異性T細胞的活化和初始擴增培養(yǎng)具體包括如下步驟:
[0019]2.1將步驟一中最終收集的負載了腫瘤抗原的DC細胞與外周血T細胞按照1:1-1:100的比例混合，用含lng/ml-100ng/ml IL-21的T細胞完全培養(yǎng)基(在RPMI1640培養(yǎng)基中加入 25mmol/L HEPES PH 7.2，1001 M/ml 盤尼西林，100 μ g/ml 鏈霉素，2mmol/L谷氨酰胺，5.5X 10_5mol/L β -巰基乙醇，10%人AB血清)調(diào)整細胞濃度為I X 105_2X 16個/ml，接種，培養(yǎng)。
[0020]2.2第4天，去除一半培養(yǎng)基，并加入相應量含10-20001 M/ml IL-2，1-lOOOng/mlIL-7和l-1000ng/ml IL-15的T細胞完全培養(yǎng)基。
[0021]2.3第7天，去除一半培養(yǎng)基，并加入相應量含lng/ml-100ng/ml IL-21的T細胞完全培養(yǎng)基，再按DC細胞與T細胞的比值為1:1-1:100加入步驟一凍存的DC細胞
[0022]優(yōu)選的，步驟三中，所述免疫磁珠法分離抗原特異性T淋巴細胞具體包括如下步驟:
[0023]步驟2.3中加入凍存的DC細胞與T細胞共培養(yǎng)24小時后，采用⑶137免疫磁珠(美天妮，貨號130-093-476)的方法分離其中被抗原激活的T淋巴細胞(⑶137陽性)。
[0024]3.1計數(shù)細胞總數(shù)，離心去除上清。
[0025]3.2按每I X 18細胞，加入400 μ I PBS緩沖溶液。
[0026]3.3加入100 μ I CD137-PE，混勻，2-8攝氏度放置10分鐘。
[0027]3.4加入1ml PBS緩沖溶液，300xg離心10分鐘，去除上清。
[0028]3.5將細胞重懸于800 μ I PBS緩沖溶液。
[0029]3.6加入200 μ I抗PE磁珠，混勻，2-8攝氏度放置15分鐘。
[0030]3.7加入1ml PBS緩沖溶液，300xg離心10分鐘，去除上清。
[0031]3.8加入500 μ I PBS緩沖溶液重懸細胞。
[0032]3.9將LS柱放在MACS磁性分離器中，用3ml PBS緩沖溶液潤洗一次。
[0033]3.10加入步驟3.8所得細胞懸液到LS柱中，收集通過LS柱未標記的細胞到A管中，再用PBS緩沖溶液洗3次(每次使用3ml PBS緩沖溶液)，洗液也收集到A管中，得到未標記的細胞。
[0034]3.11將LS柱從磁性分離器中取出，加入5ml PBS緩沖溶液用推桿將標記的細胞洗出來，用B管收集，得到⑶137+的T細胞。
[0035]優(yōu)選的，步驟四中，所述抗原特異性T淋巴細胞的高效擴增培養(yǎng)具體包括如下步驟:
[0036]4.1將步驟三得到的⑶137陽性的T淋巴細胞，用50% CM(在RPMI1640培養(yǎng)基中加入 25mmol/L HEPES PH 7.2，1001 M/ml 盤尼西林，100 μ g/mL 鏈霉素，2mmol/L 谷氨酰胺，5.5X10_5mol/Li3-巰基乙醇，10%人AB血清)和50% AM-V混合培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，細胞濃度為1.0X 13-L OX 106/ml，加入下列試劑和因子:異體輻射致死(50Gy)的PBMC(PBMC與 T 淋巴細胞的比值為 10:1-1000:1)、0.01-0.1 μ g/ml OKT3 抗體、10-20001 M/ml IL-2,l-1000ng/ml IL-7、1-lOOOng/ml IL-15 和 l-1000ng/ml CD137-配體。
[0037]4.2第 5 天，去除上清，再加入相應量含 10