5ug CD137-配體，7.5ml AIM-V 培養(yǎng)基。
[0093]6.2 第 5 天，去除 12ml 上清，再加入 12ml 含 lOOIU/ml IL_2，5ng/ml IL_7，5ng/mlIL-15的50% CM和50% AIM-V的混合培養(yǎng)基。
[0094]6.3第6天根據(jù)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行擴(kuò)瓶(袋)培養(yǎng)，細(xì)胞濃度調(diào)整為IX 106/ml，培養(yǎng)基為含 100IU/ml IL-2，5ng/ml IL_7，5ng/ml IL-15 的 50% CM 和 50% AM-V 的混合培養(yǎng)基。
[0095]6.4擴(kuò)增培養(yǎng)到第14天，收集細(xì)胞。
[0096]實(shí)施例2
[0097]腫瘤抗原(蛋白)誘導(dǎo)的抗原特異性T淋巴細(xì)胞的分離和高效擴(kuò)增培養(yǎng)
[0098]步驟一:操作同實(shí)施例1步驟二，不同之處是2.4加入的抗原不是腫瘤細(xì)胞裂解物，而是腫瘤抗原MART-1的全長(zhǎng)蛋白。
[0099]步驟二:同實(shí)施例1步驟三。
[0100]步驟三:同實(shí)施例1步驟四。
[0101]步驟四:同實(shí)施例1步驟五。
[0102]步驟五:同實(shí)施例1步驟六。
[0103]實(shí)施例3
[0104]腫瘤抗原(多肽)誘導(dǎo)的抗原特異性T淋巴細(xì)胞的分離和高效擴(kuò)增培養(yǎng)
[0105]步驟一:DC細(xì)胞培養(yǎng)及抗原多肽負(fù)載
[0106]1.1用單采機(jī)采集外周血單個(gè)核細(xì)胞，F(xiàn)icoll分離后取中間層的細(xì)胞，生理鹽水洗2次，得到PBMC (外周血單個(gè)核細(xì)胞)。
[0107]1.2取PBMC^PA RPMI 1640培養(yǎng)基配成5X 1fVml細(xì)胞懸液，按每孔3ml接種到6孔板內(nèi)，放入培養(yǎng)箱。
[0108]1.32小時(shí)后，取出，晃動(dòng)去除上層雜細(xì)胞，留下貼壁的單核細(xì)胞(體積比其它細(xì)胞稍大)，每孔加入3ml DC培養(yǎng)基(MP無(wú)血清培養(yǎng)基，含2%自體血漿，1000IU/ml GM-CSF,1000IU/ml IL-4)ο
[0109]1.4 第 5 天，加入 DC 成熟劑(終濃度 10ng/ml LPS, 50IU/ml IFN-r)。
[0110]1.5 第 7 天，按照 100ug/ml 加入 MART-1 短肽(M27: AAGIGILTV)，4 小時(shí)后收集 DC細(xì)胞，并將一部分DC細(xì)胞凍存。
[0111]步驟二?步驟五同實(shí)施例2的。
[0112]實(shí)施例4、5
[0113]抗原特異性T淋巴細(xì)胞的分離和高效擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程如下:
[0114]步驟一?步驟六的操作過(guò)程同實(shí)施例1的，不同之處在于:
[0115](I)步驟2.4中加入腫瘤細(xì)胞裂解物的濃度不同；
[0116]實(shí)施例4:腫瘤細(xì)胞裂解物的濃度為10 μ g/ml
[0117]實(shí)施例5:腫瘤細(xì)胞裂解物的濃度為lmg/ml
[0118](2)步驟四中IL-21、IL-2、IL-7和IL-15的濃度不同；步驟4.1和4.2中DC細(xì)胞與T細(xì)胞混合的比例不同；步驟4.1中細(xì)胞調(diào)整的濃度不同；
[0119]實(shí)施例4:步驟四中 IL-21、IL-2、IL-7 和 IL-15 的濃度分別為 lng/ml、10IU/ml、Ing/mlUng/ml ;步驟4.1和4.2DC細(xì)胞與T細(xì)胞混合的比例為1:100 ;步驟4.1中細(xì)胞調(diào)整的濃度I X 15個(gè)/ml ο
[0120]實(shí)施例5:步驟四中 IL-21、IL-2、IL-7 和 IL-15 的濃度分別為 100ng/ml、2000IU/ml、1000ng/ml、1000ng/ml ;步驟4.1和4.2DC細(xì)胞與T細(xì)胞混合的比例為1:1 ;步驟4.1中細(xì)胞調(diào)整的濃度2X 16個(gè)/ml。
[0121](3)步驟六中調(diào)整細(xì)胞初始濃度不同；加入異體輻射致死(50Gy)的PBMC的數(shù)量不同；OKT3抗體、IL-2、IL-7、IL-15、CD137-配體的濃度不一樣；步驟6.3中調(diào)整細(xì)胞濃度不同；步驟6.4擴(kuò)增培養(yǎng)的天數(shù)不同。
[0122]實(shí)施例4:步驟六中調(diào)整細(xì)胞初始濃度為IX 13個(gè)/ml ;加入IX 10 6個(gè)異體輻射致死(50Gy)的PBMC ；OKT3抗體的濃度為0.0 lug/ml ;IL_2的濃度為10IU/ml ;IL_7的濃度為lng/ml ；IL-15的濃度為lng/ml ;CD137_配體的濃度為lng/ml ;步驟6.3中調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5 X 16個(gè)/ml ;步驟6.4擴(kuò)增培養(yǎng)到第7天收集細(xì)胞。
[0123]實(shí)施例5:步驟六中調(diào)整細(xì)胞初始濃度為IX 16個(gè)/ml ;加入IX 10 8個(gè)異體輻射致死(50Gy)的PBMC ；0KT3抗體的濃度為0.lug/ml ;IL_2的濃度為2000IU/ml ;IL_7的濃度為1000ng/ml ;IL_15的濃度為1000ng/ml ;CD137_配體的濃度為1000ng/ml ;步驟6.3中調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 16個(gè)/ml ;步驟6.4擴(kuò)增培養(yǎng)到第30天收集細(xì)胞。
[0124]對(duì)比例I
[0125]相比于實(shí)施例1，不進(jìn)行抗原特異性T淋巴細(xì)胞的分離和高效擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0126]步驟一:同實(shí)施例1步驟一。
[0127]步驟二:同實(shí)施例1步驟二。
[0128]步驟三:同實(shí)施例1步驟三。
[0129]步驟四:同實(shí)施例1步驟四。
[0130]步驟五:無(wú)論孔內(nèi)淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)如何，不超過(guò)一周要進(jìn)行一次半量換液。當(dāng)任何一個(gè)孔內(nèi)的淋巴細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，將所有孔內(nèi)的細(xì)胞混勻，均分為2份，補(bǔ)加含100IU/ml IL-2,5ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15的T細(xì)胞完全培養(yǎng)基，或者將細(xì)胞濃度調(diào)整為0.8?1.6 X 16個(gè)/ml。培養(yǎng)至第21天，收集細(xì)胞。
[0131]對(duì)比例2
[0132]相比于實(shí)施例2，不進(jìn)行抗原特異性T淋巴細(xì)胞的分離和高效擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0133]步驟一:同實(shí)施例2步驟一。
[0134]步驟二:同實(shí)施例2步驟二。
[0135]步驟三:同實(shí)施例2步驟三。
[0136]步驟四:同對(duì)比例I步驟五
[0137]對(duì)比例3
[0138]相比于實(shí)施例3，不進(jìn)行抗原特異性T淋巴細(xì)胞的分離和高效擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0139]步驟一:同實(shí)施例3步驟一。
[0140]步驟二:同實(shí)施例3步驟二。
[0141 ] 步驟三:同實(shí)施例3步驟三。
[0142]步驟四:同對(duì)比例I步驟五
[0143]對(duì)比例4
[0144]相比于實(shí)施例1，不進(jìn)行高效擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0145]步驟一?步驟五同實(shí)施例1.
[0146]步驟六:將步驟五篩選出的⑶137陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞，按每IX 15細(xì)胞與下列試劑和因子混合培養(yǎng):CM培養(yǎng)基7.5ml，2X 17異體輻射致死(50Gy)的PBMC，450ng OKT3抗體，7.5ml AM-V培養(yǎng)基。
[0147]4.2 第 2 天加入 IL-2 至 6000IU/ml。
[0148]4.3 第 5 天，去除 120ml 上清，再加入 12ml 含 6000IU/ml IL-2 的 50% CM 和 50%AIM-V的混合培養(yǎng)基。
[0149]4.4第6天根據(jù)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行擴(kuò)瓶培養(yǎng)，細(xì)胞濃度調(diào)整為IX 106/ml，培養(yǎng)基為6000IU/ml IL-2 的 50% CM 和 50% AIM-V 的混合培養(yǎng)基。
[0150]4.5擴(kuò)增培養(yǎng)至第14天，收集細(xì)胞。
[0151]對(duì)比例5
[0152]相比于實(shí)施例2，不進(jìn)行高效擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0153]步驟一?步驟四同實(shí)施例2。
[0154]步驟五同對(duì)比例4步驟六。
[0155]對(duì)比例6
[0156]相比于實(shí)施例3，不進(jìn)行高效擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0157]步驟一?步驟四同實(shí)施例3。
[0158]步驟五同對(duì)比例4步驟六。
[0159]增殖實(shí)驗(yàn)
[0160]對(duì)實(shí)施例1和對(duì)比例4最終得到的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算增殖倍數(shù)；
[0161]對(duì)實(shí)施例2和對(duì)比例5最終得到的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算增殖倍數(shù)；
[0162]對(duì)實(shí)施例3和對(duì)比例6最終得到的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算增殖倍數(shù)。
[0163]結(jié)果:見(jiàn)圖1、圖2、圖3。
[0164]結(jié)論:實(shí)施例1?3采用本發(fā)明高效擴(kuò)增培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)中加入⑶137L (⑶137-配體)、IL-7，IL-15，IL-2相比于對(duì)比例4?6采用現(xiàn)有技術(shù)大大提高培養(yǎng)效率，提高細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。
[0165]殺瘤實(shí)驗(yàn)
[0166]步驟一:腫瘤組織單細(xì)胞懸液的制備。
[0167]取腫瘤組織塊，去除正常