一種檢測水體重金屬鎘的微生物學方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測水體重金屬鎘的微生物學方法，具體涉及利用基因工程技術 改造的大腸埃希氏菌的構建方法，及建立其在檢測水體環(huán)境中重金屬鎘的方法。
【背景技術】
[0002] 重金屬鎘（Cadmium，Cd)是被國際癌癥研宄署（IARC)歸類為第一類的人類致癌 物；美國國家毒理學計劃（NTP)也把鎘確認為人類致癌物。水體重金屬鎘污染已經(jīng)在我國 局部地區(qū)表現(xiàn)為公害病，如廣東鎘大米事件、廣西龍江鎘污染事件等，引起了人們的高度重 視。鎘在環(huán)境中非常穩(wěn)定，不易被生物降解，在水體和土壤中的含量逐年增加，繼而在一些 植物或動物體內(nèi)積累，如鎘污染區(qū)的大米、貝殼類海鮮、動物肝腎臟等，并通過食物鏈在人 體內(nèi)蓄積，為目前已知的最易在體內(nèi)蓄積的毒物之一。鎘對人體毒性很大，對腎、肺、肝、睪 丸、腦、骨骼及血液系統(tǒng)均可產(chǎn)生毒性，主要積蓄在腎臟，引起泌尿系統(tǒng)的功能變化，一旦進 入人體將很難排除。鎘能夠干擾骨中鈣，如果長期攝入微量鎘，使骨骼嚴重軟化，骨頭寸斷， 弓丨起骨痛病，其還會引起胃臟功能失調(diào)，并干擾人體和生物體內(nèi)鋅的酶系統(tǒng)，導致高血壓癥 上升。隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，鎘及其化合物被廣泛應用于電鍍等行業(yè)。鎘對環(huán)境的污染，主 要是由工業(yè)廢水排放引起（我國《污水綜合排放標準》GB8978-1996規(guī)定工業(yè)廢水中鎘 的最高排放濃度為〇. Img · Γ1)。因此，對環(huán)境水體中重金屬鎘的檢測顯得尤為必要。
[0003] 目前監(jiān)測和檢測重金屬污染物主要有兩種方法：（1)物理化學分析法，如電感耦 合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES)、電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS)等，其優(yōu)點是具備 高檢測靈敏度和高特異性，但也存在一些不足，如儀器設備昂貴，操作復雜，檢測周期長，最 重要的一點是，傳統(tǒng)的物理化學方法主要是對環(huán)境重金屬總量進行測定，不能檢測重金屬 的生物可利用度；（2)基于生物有機體的微生物法，其一般分為基于質(zhì)粒和基于基因組整 合型兩種。質(zhì)粒整合型具有成本低、特異性強、快速、易操作等優(yōu)點，但是基于質(zhì)粒載體的工 程菌株存在細菌傳代后質(zhì)?？截悢?shù)不均一，數(shù)量過高或丟失而導致檢測信號不穩(wěn)定、熒光 本底值高和獨立實驗重復性不好等缺陷。
[0004] 生物檢測技術的基本原理即是利用模式生物對特定化學物質(zhì)的分子反應機理。對 于生物檢測技術而言需要三種必需的元件：針對特定或具有相似性質(zhì)的化學物質(zhì)的感應 器；由感應器控制的啟動子；受此啟動子控制的報告基因。在設計生物檢測技術時，由于細 菌具有在環(huán)境中大量存在、生長快速、低成本及易維護等優(yōu)點而受到研宄人員普遍親睞。在 過去的研宄中利用生物檢測法來檢測環(huán)境中的特定污染物已經(jīng)引起了極大的關注，至今已 經(jīng)研發(fā)了一系列針對特定有機物和無機化合物的工程菌株及其產(chǎn)品，如：重金屬、甲苯及其 衍生物等。
[0005] 目前對鎘離子測定的生物檢測技術也有所研發(fā)，但是目前大腸埃希氏菌對鎘的具 體耐受機制仍未清晰，大腸埃希氏菌具有精細的調(diào)控系統(tǒng)使得細胞內(nèi)鎘離子保持在較低的 水平，但我們已發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌中負責編碼將鎘離子泵出的P-Type ATPase基因 zntA 及其調(diào)節(jié)蛋白基因 zntR。由于zntA基因的啟動子對鎘并非完全特異，它還能被鋅、鉛等 離子非特異性啟動，所以不能直接利用zntA基因的啟動子來介導特異反應。另據(jù)Kaisa M. Hakkila 等在文獻 Cd-specific mutants of mercury-sensing regulatory protein MerR，generated by directed evolution, Appl Environ Microbiol. 2011Sep ；77 (17)： 6215-24.報道，經(jīng)過定點突變后的革蘭陰性菌中汞離子調(diào)節(jié)蛋白MerR突變體，能與鎘離 子特異結合從而特異啟動子啟動下游基因表達，其對鎘離子的特異性已得到證實。因此我 們將在大腸埃希氏菌工程菌中引入定點突變后的MerR突變體基因 MerR(M)作為鎘離子 特異反應蛋白的編碼基因。我們嘗試將異源的調(diào)節(jié)蛋白基因 MerR(M)、啟動子pmerR和報 告基因 gfpmut2融合在一起組成含有雙啟動子的檢測元件，整合到大腸埃希氏菌基因組 中。熒光蛋白基因是常用的報告基因，此發(fā)明我們將gfpmut2熒光蛋白作為報告基因用來 替換啟動子下游基因，所以當環(huán)境中的鎘離子與調(diào)芐基因結合后，啟動子啟動下游熒光蛋 白基因的表達，從而通過熒光蛋白熒光強度反應鎘離子濃度。這個機理提供了一個很好的 檢測模式，但鎘是一種常見的劇毒性環(huán)境污染重金屬，大部分細菌對鎘具有耐受性以及抗 性，故其敏感性不高。且這些研宄是基于質(zhì)粒作為表達載體，然而基于質(zhì)粒載體的生物檢 測元件存在本底值高，細菌傳代后質(zhì)?？截悢?shù)不均一，數(shù)量過高或丟失，導致檢測信號不穩(wěn) 定等缺陷。其作為檢測鎘的宿主菌會造成檢測的不穩(wěn)定和最低檢測限偏高，這些非常不 利于污染物的檢測，必須采用新的方法提高生物學檢測方法檢測鎘離子的敏感性，以有效 解決當前環(huán)境監(jiān)測工作中遇到的瓶頸問題。Riether K等在文獻Assessment of heavy metal bioavailability using Escherichia coli zntAp ： ：lux and copAp ： ：lux-based biosensors. Applied Microbiology and Biotechnology，2002 ;57 (5-6) :712-6.中構建的 基于質(zhì)粒的pZNT-lux的大腸埃希氏菌生物傳感器，其構建策略是將大腸埃希氏菌zntA啟 動子與luxCDABE基因進行基因融合，再連接到pU⑶615質(zhì)粒載體上。其同時能被鎘、鉛、 汞、鋅誘導發(fā)光，因此，缺乏特異性，且是在野生大腸埃希氏菌基礎上構建檢測鎘離子的模 式生物，存在上述缺陷。在專利《一種檢測鎘生物可利用度的微生物細胞傳感器》CN公開 號：102911906A中，大腸埃希氏菌E. coli作為宿主細胞承載重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒為含有 金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureu pl258質(zhì)粒鎘抗性操縱子cad的啟動子序列、鎘 抗性系統(tǒng)調(diào)控基因 cadC、熒光素酶基因 Iuc和T7終止子串聯(lián)序列的pUC18質(zhì)粒，同樣是基 于質(zhì)粒的微生物傳感器，存在上述基于質(zhì)粒作為表達載體的多種缺陷，且金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureu p 1258質(zhì)粒鎘抗性操縱子cad，可同時被鉛、鎘、鋅誘導，缺乏特異性 檢測鎘的特性。
[0006] 本發(fā)明所述大腸埃希氏菌工程菌株可以克服這些不足，構建一種特異、敏感和快 速檢測鎘的大腸埃希氏菌菌株，為檢測水體中鎘奠定基礎。經(jīng)檢索本研宄構建的工程菌株 在國內(nèi)外均無文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是通過基因敲除和基因敲入技術構建一種檢測元件整合到基因組 上的大腸埃希氏菌工程菌株，從而建立一種特異、穩(wěn)定和快速檢測水體中重金屬鎘的微生 物學方法，本發(fā)明具體構建及熒光檢測示意圖如附圖1所示。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】
之一：提供一種檢測水體中重金屬鎘的大腸埃希氏菌工程菌株，本發(fā)明 的大腸埃希氏菌（Escherichia coli)WMC_009,已于2014年9月29日在中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC No. 9747(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號院3號，中國科學院微生物研宄所，郵編100101)保藏，分類命名為大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)WMC-009,保藏編號為 CGMCC No. 9747。
[0009] L 本發(fā)明 E. coli WMC-009CGMCC No. 9747 的構建方法如下：
[0010] I. 1基因敲除野生型大腸埃希氏菌基因組中ZntA和ZntR基因
[0011] 采用Red重組系統(tǒng)，敲除野生型大腸埃希氏菌基因組中兩個鎘離子"外排泵"基 因：zntA，序列如SEQ ID NO. 1所示和zntR，序列如SEQ ID NO. 2所示，構建大腸埃希氏菌 雙基因敲除菌株AzntAAzntR;
[0012] 1. 2構建金屬鎘檢測元件pmerR-MerR(M) -pmerR-gfpmut2融合基因
[0013] 將異源鎘離子調(diào)芐基因 MerR(M)，序列如SEQ ID NO. 5所示，啟動子pmerR， 序列如SEQ ID NO. 4所示以及熒光報告基因 gfpmut2,序列如SEQ ID NO. 3所 示，通過交叉PCR技術，構建含有雙啟動子的重金屬鎘離子特異反應的檢測元件： pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2 融合基因；
[0014] 1. 3采用基因敲入技術構建檢測重金屬鎘的大腸埃希氏菌工程菌株
[0015] 采用基因敲入技術將含有增強型綠色熒光蛋白報告基因檢測元件 pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2置換到AzntAAzntR菌株基因組中zntR基因編碼框位 置。具體方法為：通過交叉PCR技術，形成含有融合基因 pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2和 zntR 基因兩側同源臂，的融合片段 zntRj^i-pmerR-MerlUi/D-pmerR-gfpmutZ-zntRcK。，該 DNA融合片段大小約為2. 3kb，zntR基因 N端同源臂基因 zntR-N，序列如SEQ ID NO. 26所 示以及zntR基因 C端同源臂基因 zntR-C，序列如SEQ ID NO. 27所示，然后連接到pKOV條 件復制質(zhì)粒，構建 pK0V-zntRN()_Ni-pmerR-MerR(M) -pmerR-gfpmutZ-zntRGi-。。打祀載體，并將 該打靶載體轉(zhuǎn)化到△ zntA △ zntR菌株中，通過溫度及蔗糖的選擇，挑選成功發(fā)生兩次同源 重組的菌株，并進一步通過菌落PCR及測序鑒定篩選目的菌株。
[0016] 2.本發(fā)明所述大腸埃希氏菌菌株可以定量檢測水體中重金屬鎘的原理如下：
[0017] 本發(fā)明所述大腸埃希氏菌菌株定量檢測水體中鎘離子是采用pmerR啟動子直接 啟動gfpmut2基因表達模式。在此構建中，當未添加外源性鎘離子時，E. coli WMC-009基因 組中MerR(M)基因編碼產(chǎn)生的MerR(M)蛋白結合于pmerR啟動子序列區(qū)，阻止GFPmut2表 達；當外源性鎘離子進入大腸埃希氏菌胞內(nèi)后，Cd 2+與MerR(M)蛋白結合，使MerR(M)蛋白 從啟動子上脫落，激活E. coli WMC-009基因組中pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2融合基因 的表達，從而產(chǎn)生GFPmut2蛋白，并且產(chǎn)生的GFPmut2蛋白的量或其熒光強度與鎘離子濃度 呈劑量依賴關系，所以通過測定熒光強度可以達到定量檢測鎘離子濃度的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0018] 之二：建立一種本發(fā)明所構建的大腸埃希氏菌菌株檢測水體中鎘的微生 物學方法。
[0019] 本發(fā)明所述大腸埃希氏菌菌株檢測水體中重金屬鎘的應用實施方案如下：
[0020] 1.環(huán)境水體樣品測定的準備：
[0021] 取10-50ml待測環(huán)境水體樣品，12, OOOg離心5min，取上清，用0. 5M稀鹽酸或氫氧 化鈉溶液調(diào)節(jié)上清樣品的pH值為6-8,再用0. 22 μ m的無菌針頭濾器過濾，過濾后樣品用于 后續(xù)的測定。
[0022] 2. LB培養(yǎng)基的配制：
[0023] LB 培養(yǎng)基組份濃度為 I % (W/V) Tryptone、0· 5 % (W/V) Yeast Extract、I % (W/V) 似〇1、80%(￥/￥)去離子水，高溫高壓滅菌后冷卻至室溫，加入10%(￥八）體積？!17.2的 400mmol/L的無菌MOPS緩沖液后均勾混合。
[0024] 3.標準曲線的制定：
[0025] 把鎘單元素標準品用無菌MilliQ級的純水稀釋成適當?shù)臐舛忍荻取?br>[0026] 3.1從保存的甘油菌E.coliWMC-009菌株中取5-10μl接入新鮮5mlLB培養(yǎng)基， 37°C，250rpm過夜培養(yǎng)；
[0027] 3. 2取5-10μ 1步驟3. 1的E. coli WMC-009過夜菌加入到LB培養(yǎng)基中，37°C， 250rpm，恒溫震蕩培養(yǎng)至OD6J直在0· 02-0. 6, OD 6(J直0· 3時為最佳值，取90-900 μ 1菌液 分裝至96孔透明底黑色微孔板或15 X 150_規(guī)格的檢測管內(nèi)，同時在每個檢測孔或檢測管 內(nèi)加入10-100 μ 1鎘單元素標準品，另加等體積無菌MilliQ級純水作為陰性對照，每種水 體樣品或標準品各做3個平行孔或3個平行管，37°C、250rpm振蕩孵育2-6h，最佳孵育時間 為5h ;
[0028] 3. 3將步驟3. 2經(jīng)誘導后的菌液，4, OOOrpm，水平離心10min，棄上清，收獲的菌 體重懸于Iml DB緩沖液中，制成菌懸液，其中DB緩沖液含有500mMNaCl、20mM Tris-HCl、 20 μ g/ml氯霉素并調(diào)節(jié)pH至8· 0 ;
[0029] 3. 4將步驟3. 3的菌懸液稀釋0-20倍，使E. coI i WMC-009全細胞懸浮液的 0D_< 0. 3,混勻，分別測量其稀釋液OD 6(J直與熒光值，激發(fā)波長為481nm，發(fā)射波長為 510nm ；
[0030] 3. 5數(shù)據(jù)處理：
[0031] 相對焚光值（Relative fluorescence unit，RFU) :RFUM= F M/0D6_，F(xiàn)m為與鎘單 元素標準品孵育E. coli WMC-009菌懸液的熒光值，0D_M為與鎘單元素標準品孵育E. coli WMC-009菌懸液的吸光度；RFUw= F W/0D6QQW，F(xiàn)w為與MilliQ級純水孵育E. coli WMC-009菌 懸液的背景熒光值，OD6tltiw為與Mi