usle 鍵，聽(tīng)到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入1ml TB重懸，轉(zhuǎn)移至EP管，37°C，150rpm振蕩培養(yǎng) Ih進(jìn)行抗性恢復(fù)。然后將菌液于5, OOOrpm，25°C離心5min，取200 μ 1上清重懸沉淀，涂于 TB-CM+平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，平板上出現(xiàn)菌落，說(shuō)明轉(zhuǎn)化成功。
[0090] 2. 5cat基因的PCR鑒定
[0091] 從步驟2. 4轉(zhuǎn)化平板上取一單菌落接種于3ml TB-Cm+試管中，37°C，250rpm振 蕩培養(yǎng)4h，待菌液出現(xiàn)明顯渾濁后取Iml菌液作PCR鑒定。將菌液于1.5ml的EP管中， 8,000印111，離心3111；[11，棄上清，菌體用111111;[11丨( >)!120重懸洗絳兩次后，沸水煮10111；[11， 12, OOOrpm離心3min，作為模板，混勻。利用引物zntA-HIPl和zntA-H2P2,按表4配制PCR 反應(yīng)體系。
[0092] 表 4
[0093]
[0094] PCR 反應(yīng)條件如下：PCR 反應(yīng)條件如下：95 °C 5min ;95 °C 40sec，66 °C 2min， 72°C 2min 25個(gè)循環(huán)；4°C保存。取PCR產(chǎn)物5 μ I以I. 0%的Agarose凝膠電泳鑒定。結(jié) 果如圖5所示，在1，500bp左右出現(xiàn)亮帶，證明zntA基因已被cat基因替換。
[0095] 2. 6pCP20 的轉(zhuǎn)化
[0096] 將pCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入通過(guò)冷CaCl2法制備的步驟2. 5鑒定正確的含有cat基因的 感受態(tài)細(xì)胞，菌液均勻涂板于LB-Amp+-Cm+板上，待菌液充分吸收后倒置平板，30°C培養(yǎng)過(guò) 夜。
[0097] 2. 7cat抗性基因的消除
[0098] 用接種針從步驟2. 6細(xì)菌轉(zhuǎn)化平板上取一個(gè)單菌落接種于3ml LB液體培養(yǎng)基中， 42°C，250rpm振蕩培養(yǎng)4h左右；取一菌環(huán)四區(qū)劃線接種于LB平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。用接 種針?lè)謩e從37°C培養(yǎng)過(guò)夜的細(xì)菌平板上挑取3個(gè)單菌落，此時(shí)cat基因已去除，pCP20質(zhì)粒 已丟失，分別點(diǎn)種于LB-Cm +與LB空白平板上，置于37°C培養(yǎng)6h左右；在LB-Cm +平板上不 生長(zhǎng)而LB平板上生長(zhǎng)的細(xì)菌，cat基因已成功去除。進(jìn)一步通過(guò)PCR鑒定，證明cat基因 已完全清除。挑取菌落直接加入100 μ 1水中煮沸IOmin后，離心作為模板，用鑒定引物按 表4配制PCR體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖5所示，基因條帶大小與理論值相符，說(shuō)明已經(jīng) 成功完成znt4基因的敲除，得到zntA單突變菌Δ zntA。
[0099] 2. 8 Δ znt4單突變菌的純化
[0100] 從步驟2. 7中AzntA四區(qū)劃線平板上挑取單菌落，用接種環(huán)蘸取少許細(xì)菌四區(qū)劃 線于新的LB平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。余下菌落挑至100 μ 1無(wú)菌水中，煮沸IOmin后離心，去 上清作為模板用鑒定引物按2. 5中步驟進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確后得到純化的單突變菌。
[0101] 三、雙突變菌Δ zntA Δ zntR制備
[0102] 在AzntA單突變菌基礎(chǔ)上敲除zntR基因，制備得到雙基因突變菌，方法同單突變 菌的制備，具體步驟如下：
[0103] 3. IPCR擴(kuò)增含zntR上下游50bp同源臂帶FRT位點(diǎn)的氯霉素抗性基因
[0104] 取含有質(zhì)粒pKD3的大腸埃希氏菌過(guò)夜菌液Iml于I. 5ml的EP管中，12, OOOrpm， 離心lmin，棄上清，菌體用Iml無(wú)菌MilliQ H2O重懸洗絳兩次后，沸水煮lOmin，12, OOOrpm 離心3min，按照表5配制PCR反應(yīng)管，混勻。
[0105] 表 5
[0106]
[0107] PCR 反應(yīng)條件如下：95°C 3min ;95°C 40sec，48°C 40sec，72°C 2min，35 個(gè)循環(huán)； 72°C 10min，4°C30min。產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定，如附圖4。PCR產(chǎn)物用純化 試劑盒進(jìn)行純化，最后加適量的無(wú)菌MilliQ H2O溶解洗脫備用。
[0108] 3. 2將擴(kuò)增的氯霉素抗性基因轉(zhuǎn)入Red重組酶的菌株中
[0109] 將轉(zhuǎn)化有pKD46的大腸埃希氏菌接種于3ml LB-Amp+液體培養(yǎng)基中，30 °C培養(yǎng) 過(guò)夜，次日1 : 100接種至含有50ml LB-Amp+液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至OD 6QQ= 0. 1時(shí)， 1 : 500加入20%L-阿拉伯糖，誘導(dǎo)至0D6(I(I~0.5時(shí)制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)，40μ1/每管。將步 驟3. 1中擴(kuò)增的片段取5 μ 1加入感受態(tài)菌株，用Bio-Rad電擊儀電轉(zhuǎn)化，電擊條件：200 Ω， 25以？，電擊電壓2.51^，電擊時(shí)間51118，電擊后迅速加入111111^，250印111，37°〇培養(yǎng)1.511，之 后涂布于LB-Cm +平板，次日觀察。
[0110] 3. 3選擇氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體
[0111] 挑取步驟3. 2中氯霉素平板上長(zhǎng)出的菌落，接種于5ml LB-Cm+液體培養(yǎng)基中， 250rpm，37°C培養(yǎng)至肉眼可見(jiàn)的渾濁。取Iml于I. 5ml的EP管中，12, OOOrpm，離心lmin，棄 上清，菌體用Iml無(wú)菌MilliQ H2O重懸洗絳兩次后，沸水煮lOmin，12, OOOrpm離心3min，按 照表6配制PCR反應(yīng)體系，混勻。
[0112] 表 6
[0113]
[0114] PCR 反應(yīng)條件如下：95°C 3min ;95°C 40sec，52°C 40sec，72°C 2min，25 個(gè)循環(huán)； 72°C 10min，4°C 30min。產(chǎn)物以I. 0%的Agarose凝膠電泳鑒定，如附圖6。
[0115] 3. 4FLP重組酶消除氯霉素抗性基因
[0116] 將pCP20轉(zhuǎn)入步驟3. 3氯霉素抗性陽(yáng)性的菌落中，30°C培養(yǎng)IOh后轉(zhuǎn)換溫度至 42°C，250rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。接種環(huán)醮取過(guò)夜菌液涂布于無(wú)抗性LB平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。 過(guò)夜無(wú)抗平板長(zhǎng)出的菌落，分別先后分格劃線于新氯霉素抗性和無(wú)抗性LB平板，37°C培養(yǎng) 過(guò)夜。選取氯霉素抗性無(wú)生長(zhǎng)和無(wú)抗性LB平板生長(zhǎng)的單菌落增菌，用鑒定引物按表6配制 PCR體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR鑒定結(jié)果如附圖6所示，然后菌株再用2種鑒定引物鑒定，PCR 擴(kuò)增的條帶中，兩條為500bp左右，說(shuō)明已經(jīng)完成AzntA-AzntR雙突變菌制備，結(jié)果如附 圖7。
[0117] 實(shí)施例2.融合報(bào)告基因 pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2的構(gòu)建
[0118] 一、引物信息及合成
[0119] 根據(jù)GenBank公布的目的基因 pmerR和MerR(M)序列及已知的gfpmut2基 因序列，使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)表7,部分引物在基因的5'端或3'端引入 酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增pmerR-MerR (M)的引物Pmer-MerR-m-F，序列如SEQ ID NO. 20所 示和Pmer-MerR-m-R，序列如SEQ ID NO. 21所示，擴(kuò)增pmerR-gfpmut2基因的引物 Pmer-GFPmut2-F序列如 SEQ ID NO. 22所示和GFPmut2-R序列如 SEQ ID NO. 23所示，以及最 終融合片段連接到質(zhì)粒載體PMD19-T的鑒定引物M13F，序列如SEQ ID NO. 24所示和M13R， 序列如SEQ ID NO. 25所示。具體信息見(jiàn)表7,引物由invitrogene公司合成。用無(wú)菌ddH20 將引物溶解，配成濃度為10 ymol/L的儲(chǔ)存液，-20°C保存。
[0120] 表7.基因融合引物詳細(xì)信息表
[0122] 二、pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2 基因的融合及與 pMD 19-T 載體連接
[0123] 2. 1 擴(kuò)增 pmerR-MerR (M)基因
[0124] 取含有質(zhì)粒 merR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-pMDl9_T (Clonetech)的過(guò)夜菌液 Iml 于1.5ml的EP管中，8, OOOrpm，離心3min，棄上清，菌體用Iml MilliQ H2O重懸洗絳兩次 后，沸水煮l〇min，12, OOOrpm離心3min，取24 μ 1上清作為模板。按下表配成體系，做PCR 鑒定。
[0125] 表 8
[0126]
[0127] PCR 反應(yīng)條件如下：95°C、5min ;95°C、40sec，50°C、40sec，72°C、l. 5min，35 個(gè)循 環(huán)；72°C、10min，4°C保存。取5μ1產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。結(jié)果如附圖8 所示。PCR產(chǎn)物用純化試劑盒進(jìn)行純化，最后加適量的無(wú)菌MilliQ H2O溶解洗脫備用。
[0128] 2. 2PCR 擴(kuò)增 merR-gfpmut2 基因
[0129] 取含有質(zhì)粒 merR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-pMD19_T 的過(guò)夜菌液 Iml 于 I. 5ml 的 EP管中，8, OOOrpm，離心3min，棄上清，菌體用Iml MilliQ H2O重懸洗絳兩次后，沸水煮 lOmin，12, OOOrpm離心3min，取24 μ 1上清作為模板。按下表配成體系，做PCR鑒定。
[0130] 表 9
[0131]
[0132] PCR 反應(yīng)條件如下：95°C、5min ;95°C、40sec，50°C、40sec，72°C、l. 5min，35 個(gè)循 環(huán)；72°C、10min，4°C保存。取5μ1產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。結(jié)果如附圖8 所示。PCR產(chǎn)物用純化試劑盒進(jìn)行純化，最后加適量的無(wú)菌MilliQ H2O溶解洗脫備用。
[0133] 2. 3pmerR_MerR (M) -pmerR-gfpmut2 基因的融合
[0134] 將步驟2. 1和步驟2. 2的PCR產(chǎn)物，按下表10配制體系，接著再按下表11在表10 基礎(chǔ)上添加體系
[0135] 表 10
[0136]
[0137] PCR 反應(yīng)條件如下：95°C、3min ;95°C、40sec，62°C、40sec、-l°C，72°C、3min，8 個(gè)循 環(huán)；72°C、2min，4°C 保存。
[0138] 表 11
[0139]
[0140] PCR 反應(yīng)條件如下：95°C、3min ;95°C、40sec，52°C、40sec，72°C、2min，35 個(gè)循環(huán)； 72°C、10min，4°C保存。取5μ1產(chǎn)物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。結(jié)果如圖8所示。 PCR產(chǎn)物用純化試劑盒進(jìn)行純化，最后加適量的無(wú)菌MilliQ H2O溶解洗脫備用。
[0141] 2. 4PCR產(chǎn)物加 A反應(yīng)與純化
[0142] 將步驟2. 3的PCR產(chǎn)物按下表配成反應(yīng)體系：
[0143] 表 12
[0144]
[0145] PCR反應(yīng)條件如下：72°C、lh，4°C保存。PCR產(chǎn)物用純化試劑盒進(jìn)行純化，最后加適 量的無(wú)菌MilliQ H2O溶解洗脫備用。
[0146] 2. 5目的片段與pMD19-T simple載體連接
[0147] 按TaKaRa公司的pMD19_T simpLe Vector試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行T載體與目的基因 的連接。將步驟2. 4的產(chǎn)物與pMD19-T simple Vector連接反應(yīng)體系如下：
[0148] 表 13
[0149]
[0150] 16 °C，連接過(guò)儀。
[0151] 2.6 轉(zhuǎn)化
[0152] 通過(guò)冷CaClJi將步驟2. 5連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中。
[0153] 2. 7 測(cè)序
[0154] 挑選一個(gè)經(jīng)M13F/R引物，PCR鑒定正確的單克隆菌株送上海捷瑞生物工程有限公 司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI上提供的標(biāo)準(zhǔn)參考序列比對(duì)。
[0155] 2. 8 轉(zhuǎn)化
[0156] 2. 8. 1經(jīng)步驟2. 7測(cè)序正確的菌株提取質(zhì)粒，質(zhì)粒的提取采用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 3. 0 試劑盒小提質(zhì)粒；
[0157] 2. 8. 2通過(guò)冷CaClJi將步驟2. 8. 1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入Δ zntA- Δ zntR感受態(tài)細(xì)胞 中，標(biāo)記為 pmerR-MerR (M) -pmerR-gfpmut2_pMD19-T/ Δ zntA- Δ zntR 和野生型大腸埃希氏 菌感受態(tài)細(xì)胞中，并且通過(guò)PCR鑒定轉(zhuǎn)化菌種的正確性，結(jié)果如附圖9和10所示。
[0158] 實(shí)施例3.基因敲入
[0159] 一、引物信息及合成
[0160] 使用 Primer5. 0 軟件設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)表 14,設(shè)計(jì) pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2 基因 N末端和C末端的內(nèi)側(cè)引物，P2:zntR-cd-Ni，序列如SEQ ID NO. 15所 示和P5:zntR-cd-gfpmut2_Ci，序列如SEQ ID NO. 16所示以及外側(cè)引物，P1: zntR-No,序列如 SEQ ID MX 14 所示和 P6:zntR-Co,序列如 SEQ ID MX 17 所示， 使 P2:zntR-cd_Ni 與 P3:pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2_F，序列如 SEQ ID N0.18 所示，P4:pmerR-MerR(M)-pmerR-gfpmut2-R，序列如 SEQ ID NO. 19 所示，與 P s: zmR-cd-gfpmut2-Ci之間存在互補(bǔ)序列，基因敲除兩個(gè)外