一種連續(xù)化生產(chǎn)c-di-AMP的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用固定化DisA蛋白連續(xù)生產(chǎn)c-d1-AMP的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)腺苷二磷酸(Cyclic3’，5’-diadenosine monophosphate，c-d1-AMP)是近幾年在細菌和古菌中發(fā)現(xiàn)的一種新型的第二信使。作為一個在原核微生物中廣泛存在的信號分子，它是細胞生長的必需因子，不僅參與細胞壁合成、細胞形態(tài)的控制、細菌DNA的損傷性修復，而且與細菌對抗生素的抗性、病原細菌的致病性相關(guān)；c-d1-AMP還能刺激真核宿主細胞產(chǎn)生免疫應答，介導宿主產(chǎn)生干擾素，增強機體非特異性免疫的防御能力。然而，目前對于c-d1-AMP的作用機制研宄還處于起步階段，是近幾年研宄的熱點，導致科研市場對純品的c-d1-AMP有較大的需求。另一方面，最新研宄表明，c-d1-AMP可以作為一種小分子免疫佐劑，能夠強烈和長期持續(xù)刺激機體產(chǎn)生免疫應答，因此，它在疫苗佐劑的市場也存在巨大的潛力。有文獻報道可以通過化學法在使用對甲氧基保護的亞磷酰胺固相支持物表面合成c-d1-AMP，但因工藝復雜、回收率低、環(huán)境不友好和成本過高等問題，難以規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)。
[0003]c-d1-AMP合成酶(dia-denylate cyclase，DAC)在三域生命系統(tǒng)中幾乎都存在，可以在體外將兩分子的ATP合成一分子c-d1-AMP，同時生成一分子焦磷酸(圖1)。最近一篇文獻中 Cao Zheng 等(Enzyme and Microbial Technology (52) 2013，319-324)證實:在大腸桿菌中表達帶有組氨酸標簽的蘇云金芽孢桿菌thuringiensis)的DisA蛋白，具有DAC功能，從50mL反應體系中檢測到10mg的c-d1-AMP產(chǎn)物。然而，該研宄對產(chǎn)物的分離提純工藝并未進一步研宄，限制了其在規(guī)?；a(chǎn)中的應用。另外一項國際專利:W02013/066264 Al (Enzymatic synthesis of cyclic and linear diadenosinemonophosphate)提出使用來源于 Methanocaldococcus jannaschii 和 Geobacillusthermodenitrificans的兩個具有DAC功能的耐熱蛋白生物催化合成c-d1-AMP，同時生產(chǎn)焦磷酸。
[0004]然而，以上生物催化合成工藝中，幾乎使用的都是異源表達的游離酶，催化一次合成反應之后即被滅活，利用率不高；另外，在宿主細胞中表達之后，要先分離出純酶，在分離純化的過程由于存在蛋白酶等因素會使酶的量和活性受到影響?？傊两駷橹?，c-d1-AMP酶法生物合成仍然存在成本高、工藝復雜和商業(yè)化生產(chǎn)可行性不強等現(xiàn)狀，因此，此類方法還有很大的技術(shù)革新的空間。CBM (Cellulose Binding Motif)是一類大多數(shù)纖維素酶含有的不具有催化功能的結(jié)構(gòu)域，由30-240個氨基酸組成，能夠特異性吸附于纖維素表面但無水解活力。CBM在生物工藝學上有潛在的應用價值，可以用基因工程的方法把CBM與目的蛋白融合在一起，從而使融合蛋白或酶能特異地連到廉價而形式多樣的纖維素基質(zhì)上，從而實現(xiàn)酶的純化與固定化。Hehuan Liao等(Appl Microb1l B1technol DOI 10.1007/S00253-011-3458-1)將第三家族的CBM與多聚磷酸化葡萄糖激酶在大腸桿菌中進行融合表達，使用處理過的微晶纖維素吸附固定化后，成功催化了 6-磷酸葡萄糖的合成，并且可以重復使用多次。然而，目前針對CBM與DAC的融合表達與生物催化合成c-d1-AMP的相關(guān)研宄報道并不多，更未進行工業(yè)化應用。本發(fā)明針對這一問題，提出了一步純化和固定化二腺苷酸環(huán)化酶方法，簡化了工藝同時降低生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明通過基因工程技術(shù)手段，通過對基因的改造，使其在細胞表達后能夠進一步被固定化，從而便于連續(xù)化生產(chǎn)c-d1-AMP，從而降低c-d1-AMP的生產(chǎn)成本。
[0006]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0007]一種連續(xù)生產(chǎn)c-d1-AMP的方法，包括以下步驟:
(I)DisA基因改造，通過基因工程手段，將DisA基因與cbm基因融合構(gòu)建重組質(zhì)粒載體；
所述DisA基因編碼蛋白包括:
具有合成c-d1-AMP功能的DAC，如:枯草芽孢桿菌subtil is)的DisA蛋白(GenBank: CPOO3695.I)或蘇云金芽抱桿菌的 DisA 蛋白(GenBank: ADH04898.1);其他具有合成c-d1-AMP功能的DAC，主要是原核微生物DisA蛋白(Oppenheimer- Shaanan, et al., EMBO Rep., 2011，12，594 - 601)，其氨基酸序列與編碼枯草芽孢桿菌subti I is)的DisA蛋白具有65%以上同源性，且單個亞基具有螺旋-發(fā)卡-螺旋的結(jié)構(gòu)特征；
另外如，具有同時合成c-d1-AMP、cGAMP和c-di_GMP功能的DAC，如:霍亂弧菌(Vibr1cholerae')\)uc V 蛋白(UniProtKB: Q9KVG7.1)也可在本發(fā)明中應用；
所述c/?基因序列，使用來源于第三家族的cbm序列，由480個堿基組成，編碼160個氨基酸，屬于熱線梭菌(Clostridium thermocellum)中編碼cipA基因的一部分，GenBank:HF912724.1；
c/wz基因片段可由原材料質(zhì)粒自帶；所述原材料質(zhì)粒為:pCG質(zhì)粒(Nat.Commun.，2014,5,3026)；
所述重組質(zhì)粒載體構(gòu)建過程為:
第一，設計引物，采用PCR擴增或全基因人工合成技術(shù)得到具有DAC功能活性的基因序列，如:枯草芽孢桿菌
第二，將基因序列與pCG質(zhì)粒進行改造和重組，構(gòu)建pCG-重組質(zhì)粒載體；具體為，將pCG質(zhì)粒上編碼吉構(gòu)域基因與編碼綠色熒光蛋白(於>)基因片段相連接；同時將見■^基因序列兩端分別加上Xho I和BamH I酶切位點；
由于在連接處編碼綠色熒光蛋白(於>)基因上游存在Xho I酶切位點，而在編碼綠色熒光蛋白igfp)基因下游存在BamH I酶切位點，因而可使用Xho I和BamH I對原pCG質(zhì)粒進行雙酶切；
對連接有綠色熒光蛋白(於>)基因的pCG質(zhì)粒和增加酶切位點后基因分別采用Xho I和BamH進行雙酶切，回收雙酶切產(chǎn)物，并進行連接，即可構(gòu)建pCG-^id重組質(zhì)粒載體；
亦可米用 You等(DNA Cloning and Assembly Methods，Humana Press，2014，183-192)提供的簡單克隆方法，進行重疊延伸PCR得到重組表達質(zhì)粒pCG-1VM; pCG-DisA重組質(zhì)粒載體構(gòu)建示意圖如圖2所示；
所述pCG質(zhì)粒為美國弗吉尼亞州理工大學Y.-H.Percival Zhang教授友情贈送(Nat.Commun.，2014，5，3026)；
(2)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，CBM-DAC融合蛋白的表達；
將重組質(zhì)粒載體PCG-DisA轉(zhuǎn)入感受態(tài)宿主細胞疋coli Rosetta或BL21中，挑選陽性重組子于LB培養(yǎng)基中25~37°C培養(yǎng)，待吸光值A(chǔ)6tltl達到0.6-0.8時，使用0.05-1 M的IPTG(異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)或乳糖，16~30°C誘導16~24h，離心收獲菌體細胞；
(3)—步純化和固定化DAC酶；具體步驟如下:
第一，根據(jù)文獻(Nat.Commun.，2014，5，3026)提供的方法用磷酸對微晶纖維素進行預活化和重生；所述微晶纖維素優(yōu)選粒徑在10~100 μπι ;具體為:
稱取100~200g微晶纖維素(Aladdin，C104843_250g)，溶于0.3-0.6L去離子水中，充分混勾；
加入5~10L預冷的磷酸，邊加邊攪拌混勻，出現(xiàn)澄清；
冰上放置l~2h，每隔1min攪拌一次；然后加入20~40L預冷去離子水，邊加邊攪拌，此時出現(xiàn)白色沉淀；4°C，5000 r/min離心10~20min，棄上清，再用預冷的去離子水重懸，重復四次；
加入0.2-0.5L 2M的Na2CO3,充分混勻，中和磷酸；
加入20~45L預冷的去離子水，重懸沉淀，4°C，5000 r/min離心20min，棄上清；重復2~3次，直到微晶纖維素的PH值在5~7之間，4°C保存?zhèn)溆茫?br> 第二，破碎細胞，例如用超聲波或其他細胞破碎儀對步驟(2)收獲細胞進行破碎，8000-10000轉(zhuǎn)/min，4°C條件下離心棄沉淀；具體地，例如，向收集的誘導表達的菌體中加入10~300mL PBS重懸，加溶菌酶(終濃度為I mg/mL)和PMSF(終濃度為ImM)室溫孵育Ih后，低溫超聲波破碎菌體(超聲時間8 S，間歇10 s，200次)；4°C, 10000 r/min離心20min，取上清;
第三，將第一步中處理好微晶纖維素與第二步所收集上清液混合，室溫結(jié)合20~30min ；然后4°C、6000 r/min離心5min，棄上清；
加入 20~30mL 50mM 的 Tirs-Hcl (PH=8.5)重懸，充分混勻后，4°C、6000 r/min 離心5min，棄上清；重復3