夜，離心，收集菌體，即可用于進(jìn)一步的固定DAC即固定DisA蛋白并用于催化合成c-d1-AMP過程。
[0030]實(shí)施例2
本實(shí)施例在實(shí)施例1基礎(chǔ)上，對(duì)于一步純化和固化化CBM-DAC融合蛋白，以及利用該DisA蛋白催化合成c-d1-AMP并進(jìn)一步純化的過程做進(jìn)一步解釋說明，簡(jiǎn)要介紹如下。
[0031](3) 一步純化和固定CBM-DAC融合蛋白；具體步驟如下:
第一，根據(jù)文獻(xiàn)(Nat.Commun.，2014，5，3026)提供的方法用磷酸對(duì)微晶纖維素進(jìn)行預(yù)活化和重生；所述微晶纖維素優(yōu)選粒徑在10~100 μπι。具體為:
稱取10g微晶纖維素(Aladdin，C104843_250g)，溶于0.3L去離子水中，充分混勻； 加入5L預(yù)冷的磷酸，邊加邊攪拌混勻，出現(xiàn)澄清；
冰上放置lh，每隔1min攪拌一次；然后加入20L預(yù)冷去離子水，邊加邊攪拌，此時(shí)出現(xiàn)白色沉淀；4°C，5000 r/min離心lOmin，棄上清，再用預(yù)冷的去離子水重懸，重復(fù)四次； 加入0.2L 2M的Na2CO3,充分混勻，中和磷酸；
加入20L預(yù)冷的去離子水，重懸沉淀，4°C，5000 r/min離心20min，棄上清；重復(fù)3次，直到微晶纖維素的PH值在5~7之間，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0032]第二，破碎細(xì)胞，向?qū)嵤├?所收集的菌體加300mL PBS重懸，加溶菌酶(終濃度為I mg/ml)和PMSF(終濃度為ImM)室溫孵育Ih后，低溫超聲波破碎菌體(超聲時(shí)間8 S，間歇 10 S，200 次)；4°C, 10000 r/min 離心 20min，取上清。
[0033]第三，取第一步活化后的微晶纖維素30g(相當(dāng)于約6g干重)，和第二步所制備上清液混合，室溫結(jié)合30min，4°C，6000 r/min離心5min，棄上清。加入300mL 50mM的Tirs-HCl(PH=8.5)重懸，充分混勻后，4°C，6000 r/min離心5min，棄上清；重復(fù)3~5次，洗掉非特異性結(jié)合的蛋白。
[0034]吸附結(jié)合完成后進(jìn)行液態(tài)保藏或低溫冷凍干燥，所得產(chǎn)品即為含有固化DAC的液體酶或固體粉末。
[0035]測(cè)定結(jié)果表明，CBM-DAC融合蛋白吸附量為，Img干重微晶纖維素吸附250mg目的蛋白O
[0036]需要注意的是，液態(tài)保藏或低溫冷凍干燥之前需添加保護(hù)劑，所用保護(hù)劑為混合劑，以質(zhì)量比計(jì)，蔗糖:甘露醇:甘氨酸=3:3:1。
[0037]對(duì)最后洗滌液即帶有目的蛋白DisA蛋白的微晶纖維素進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。
[0038]測(cè)定結(jié)果表明，CBM-DAC融合蛋白吸附量為，Ig干重微晶纖維素吸附250mg目的蛋白。
[0039](4)連續(xù)化生產(chǎn) c-d1-NMP; c-d1-AMP的合成酶反應(yīng)體系設(shè)置如下:
反應(yīng)體系為5L，固定化CBM-DAC的微晶纖維素456mg(相當(dāng)于融合蛋白2μΜ)，2mM的ATP在包含1mM MgCljP 40mM的HEPES的緩沖液中，37°C反應(yīng)2小時(shí)。
[0040]反應(yīng)體系為5L，2uM DisA 蛋白與 2mM 的 ATP 在包含 1mM MgCl2 和 500mM CHES的緩沖液中，50°C反應(yīng)2小時(shí)。
[0041](5)反應(yīng)產(chǎn)物分離濃縮與純化；
反應(yīng)產(chǎn)物即c-d1-AMP的分離及純化工藝原理如圖3所示，具體包括以下步驟:
第一，步驟(4)酶促反應(yīng)結(jié)束后，12000轉(zhuǎn)/min離心回收含有固定化酶的微晶纖維素，加入 300mL 50mM 的 Tirs-HCl(ΡΗ=8.5)重懸，充分混勻后，4°C，6000 r/min 離心 5min，棄上清，重復(fù)3次；所得沉淀即為固定化CBM-DAC融合蛋白，可進(jìn)行液態(tài)保藏或低溫冷凍干燥，以備下次使用，同時(shí)得到含有反應(yīng)產(chǎn)物c-d1-AMP的澄清反應(yīng)液；將所得澄清反應(yīng)液煮沸99°C煮沸l(wèi)Omin，然后12000rmp/min離心lOmin，取上清，用0.22Mm濾器過濾
第二，將第一步所收集濾液經(jīng)膜分離器超濾，分離出殘留的大分子蛋白、無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)；再將超濾之后液體送入納濾器進(jìn)一步濃縮，脫鹽除雜；
所述超濾采用美國(guó)GE公司的三層超濾復(fù)合膜，該膜切割分子量為1000~3000道爾頓，工作壓力為1.5-3.0 Mpa，小于膜切割分子量的目的產(chǎn)物c-di_NMP (692-727道爾頓)透過該膜，同時(shí)AMP，Mg2+等小分子物質(zhì)也透過該膜，所透過物質(zhì)通過超濾器淡水口收集；未透過膜的為游離的微晶纖維素、未分離的含有固定酶DisA蛋白的微晶纖維素、游離的大分子量的DisA蛋白等，通過超濾器的濃水口收集；對(duì)超濾器濃水口收集物可返入容器中繼續(xù)進(jìn)行合成反應(yīng)；
對(duì)從超濾器淡水口收來的含有c-d1-AMP、AMP、焦磷酸、Mg2+等小分子物質(zhì)的溶液進(jìn)一步經(jīng)納濾器進(jìn)行濃縮，所述納濾采用美國(guó)GE公司的三層納濾復(fù)合膜，該膜切割分子量為500道爾頓，工作壓力為2.5 Mpa，小于膜切割分子量的目的產(chǎn)物c-d1-NMP (692~727道爾頓)無(wú)法透過該膜，而無(wú)機(jī)鹽、水、PP1、AMP等小分子透過膜，從納濾器的淡水口流出，而目的產(chǎn)物c-d1-NMP留在濃縮液中收集。
[0042]第三，用20%的氨水將納濾之后的濃縮液調(diào)至堿性(pH=10)。
[0043]第四，使用減壓蒸發(fā)裝置將調(diào)至堿性的納濾液蒸餾至液體為粘性，進(jìn)一步使用乙醇丙酮有機(jī)溶劑(體積比1:1)抽提產(chǎn)物，有機(jī)相:水相=95:5，洗滌后離心(重復(fù)兩次)，將所得固體溶解到少量的0.1%氨水中，冷凍干燥；最后所得398mg的c-d1-AMP 二銨鹽。
[0044]對(duì)所得c-d1-AMP 二銨鹽進(jìn)行檢測(cè)，以文獻(xiàn)公布的(Enz.Microb.Technol.，2013，52，319)方法，使用高效液相色譜(HPLC)技術(shù)對(duì)樣品含量進(jìn)行測(cè)定，以Sigma公司的純度為99.9%的c-d1-AMP 二銨鹽作為標(biāo)準(zhǔn)品。
[0045]檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，其中(I)表示ATP、c-di_AMP 二銨鹽在高效液相色譜柱上的保留時(shí)間；(2)表示最終產(chǎn)品中c-d1-AMP 二銨鹽在高效液相色譜柱上的保留時(shí)間。結(jié)果表明，使用本發(fā)明生產(chǎn)的c-d1-AMP 二銨鹽，純度較高，具有很好的使用價(jià)值和意義。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種連續(xù)生產(chǎn)c-d1-AMP的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)基因改造，通過基因工程手段，將基因與c/?基因融合構(gòu)建重組質(zhì)粒載體； (2)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，CBM-DAC融合蛋白的表達(dá)； (3 ) 一步純化和固定化DAC酶； 所述固定化DAC酶采用微晶纖維素進(jìn)行固定化； (4)連續(xù)化生產(chǎn)c-d1-AMP； (5)反應(yīng)產(chǎn)物分離濃縮與純化。2.如權(quán)利要求1所述連續(xù)生產(chǎn)c-d1-AMP的方法，其特征在于，步驟(I)中所述仍.s應(yīng)因編碼蛋白為枯草芽孢桿菌的DisA蛋白，其編號(hào)為，GenBank: CP003695.1。3.如權(quán)利要求1所述連續(xù)生產(chǎn)c-d1-AMP的方法，其特征在于，步驟(I)中所述c/wz基因序列，使用來源于第三家族的Cbmfm，由480個(gè)堿基組成，編碼160個(gè)氨基酸，屬于熱線梭智\ Clostridium應(yīng)中編碼 cipA 基因的一部分，編號(hào)為，GenBank: HF912724.1 ；具體采用pCG質(zhì)粒中c/wz基因片段。4.如權(quán)利要求1所述連續(xù)生產(chǎn)c-d1-AMP的方法，其特征在于，步驟(2)中轉(zhuǎn)化所采用宿主細(xì)胞為E.coli Rosetta。5.如權(quán)利要求1所述連續(xù)生產(chǎn)c-d1-AMP的方法，其特征在于，步驟(3)中所述微晶纖維素粒徑在10~100μπι。6.如權(quán)利要求1所述連續(xù)生產(chǎn)c-d1-AMP的方法，其特征在于，連續(xù)化生產(chǎn)c-d1-AMP時(shí)，酶反應(yīng)體系設(shè)置如下: 步驟(3)中固定化DAC的微晶纖維素，456~2280 mg ； 底物，ATP 10-100 mM ； 40-100 mM HEPES 或 300~700 mM CHES 緩沖液；5-30 mM Mg2+; 30~65°C，反應(yīng) l~4h。7.如權(quán)利要求1所述連續(xù)生產(chǎn)c-d1-AMP的方法，其特征在于，所述分離濃縮純化依次包括離心、超濾、納濾、調(diào)PH值、減壓蒸發(fā)、冷凍干燥步驟； 所述超濾采用美國(guó)GE公司的三層超濾復(fù)合膜； 所述納濾采用美國(guó)GE公司的三層納濾復(fù)合膜。
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用固定化DisA蛋白連續(xù)生產(chǎn)c-di-AMP的方法。該方法步驟：1、DisA基因改造，通過基因工程手段，將DisA基因與cbm基因融合構(gòu)建重組質(zhì)粒載體；2、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，CBM-DAC融合蛋白的表達(dá)；3、一步純化和固定化DAC酶；4、連續(xù)化生產(chǎn)c-di-AMP；5、反應(yīng)產(chǎn)物分離濃縮與純化。本發(fā)明特異性的利用了CBM結(jié)構(gòu)域與纖維素結(jié)合但無(wú)水解功能的特點(diǎn)，工藝較為成熟，生產(chǎn)成本低廉，環(huán)境友好，所制備的DAC酶類型多樣，來源廣泛，而且濃度、純度較高，酶促反應(yīng)效率較高，因而具有較好的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12N11/12, C12N15/62, C12P19/28, C12R1/19
【公開號(hào)】CN104946705
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510281173
【發(fā)明人】楊國(guó)宇, 張改平, 楊森, 孔江南, 張超, 韓瑩倩, 郭豫杰
【申請(qǐng)人】河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年5月28日