安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記 的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是生豬養(yǎng)殖大國(guó)，也是豬肉消費(fèi)大國(guó)，隨著社會(huì)的發(fā)展，生豬養(yǎng)殖規(guī)?；潭?越來越高，各種疾病的預(yù)防和控制變得更加重要和嚴(yán)峻。提高豬群的一般抗病力，有助于降 低生產(chǎn)成本，更有利于減少藥物殘留，提高豬肉產(chǎn)品質(zhì)量、公共衛(wèi)生安全及動(dòng)物福利等。研 宄發(fā)現(xiàn)，一些豬病的發(fā)病機(jī)制是和豬本身的遺傳背景相關(guān)的，因此應(yīng)用遺傳學(xué)方法，從遺傳 基礎(chǔ)上提高豬對(duì)疾病的抗性具有治本的功效。隨著豬基因組學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，各種抗性 相關(guān)基因的核酸序列和功能的研宄為豬抗病育種有效遺傳標(biāo)記的篩選和確定提供了可能。
[0003]抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體 1(transporterlassociatedwithantigen processing,TAPI)是參與介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源性抗原與MHCI類分子結(jié)合以供T細(xì)胞識(shí)別過程中 一個(gè)重要的組成部分，在免疫應(yīng)答中起著重要的作用，與機(jī)體的一般抗病力有著密切關(guān)系。 在人類上的研宄已表明，TAP基因的多態(tài)性會(huì)改變機(jī)體的免疫應(yīng)答，影響個(gè)體對(duì)疾病的易感 性。豬TAP1基因位于7號(hào)染色體上，橫跨8. 63kb，共11個(gè)外顯子，編碼746個(gè)氨基酸。在 豬上已有研宄表明TAP1基因外顯子2G729A位點(diǎn)對(duì)TAP1基因表達(dá)和部分免疫指標(biāo)具有明 顯的遺傳效應(yīng)；且亦有研宄分析了TAP1基因作為豬抗病育種分子標(biāo)記的可行性，結(jié)果表明 TAP1基因在杜洛克、長(zhǎng)白、大白和皮特蘭4個(gè)品種中表現(xiàn)出與相關(guān)生產(chǎn)性狀無關(guān)，因此對(duì)它 抗病性能的選擇利用將不會(huì)造成其他性能的下降。鑒于TAP1基因在動(dòng)物機(jī)體免疫應(yīng)答中 的重要性，對(duì)其多態(tài)性和遺傳效應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)分析具有重要的理論和實(shí)踐意義。
[0004] 斷奶仔豬腹瀉以及水腫病是當(dāng)今規(guī)?；i場(chǎng)養(yǎng)殖中一種常見的疾病。在仔豬的飼 養(yǎng)管理過程中，斷奶是一個(gè)極其重要的環(huán)節(jié)。仔豬斷奶后，由于斷奶應(yīng)激，仔豬自身消化系 統(tǒng)尚未發(fā)育完全，再加上來自母體的抗體來源終止等外界不良因素的影響，常常易導(dǎo)致仔 豬斷奶后發(fā)生腹瀉（Post-weaning diarrhea, PWD)和水腫?。∣edema disease, 0D)，其中 F18大腸桿菌是最主要的致病源。至今為止，對(duì)于致病性大腸桿菌造成的危害，仍沒有有效 的預(yù)防措施和治療方法，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0005] 本發(fā)明所述研宄以安徽三個(gè)本地品種（圩豬、皖南黑豬及霍壽黑豬）和一個(gè)外來 品種大白豬為試驗(yàn)對(duì)象，檢測(cè)在該四個(gè)群體中TAP1基因的遺傳變異。通過測(cè)定在易感染 F18大腸桿菌的斷奶培育時(shí)期仔豬的血清免疫指標(biāo)，進(jìn)行品種間的差異分析、以及基因型間 的關(guān)聯(lián)性分析，探討斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)在不同品種間的差異以及TAP1基因多態(tài)性對(duì) 不同種群斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的遺傳效應(yīng)。旨在尋找與安徽地方豬種抗病性狀相關(guān)的有 效遺傳標(biāo)記，為安徽省地方豬種種質(zhì)資源特性及抗病育種研宄提供分子生物學(xué)參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩 選方法，本發(fā)明方法具有檢測(cè)效果理想、成本低、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。
[0007] -種安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，包括如下步驟：
[0008] (1)對(duì)照動(dòng)物模型的選擇：選擇安徽省地方豬種圩豬、霍壽黑豬、皖南黑豬與外來 豬種大白豬28日齡斷奶仔豬為研宄免疫指標(biāo)品種差異的對(duì)照動(dòng)物模型；
[0009] (2)樣品采集：仔豬35日齡時(shí)，采集耳樣組織并空腹采血；
[0010] (3)耳樣組織DNA提??；
[0011] (4)PCR擴(kuò)增抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體1 (transporter associated with antigen processing, TAPI)基因目的片段；
[0012] (5)檢測(cè)目的片段單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Single-StrandConformation Polymorphism,SSCP)；
[0013] (6)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測(cè)序；
[0014] (7)群體遺傳學(xué)特性分析；
[0015] (8)仔豬血清免疫指標(biāo)的測(cè)定；
[0016] (9)采用數(shù)學(xué)模型分析所檢測(cè)到的TAP1基因的遺傳變異與血清免疫指標(biāo)的關(guān)聯(lián) 性，并分析品種間血清免疫指標(biāo)的差異性。
[0017] 根據(jù)TAP1 基因單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)與免疫 指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析，探討所檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)對(duì)不同豬群斷奶仔豬抗病性的指標(biāo)是否有影 響，從而判定所檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)能否作為仔豬抗病育種的有效遺傳標(biāo)記。
[0018] 本發(fā)明所述的安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其中，所述步驟 (1) 中所述對(duì)照動(dòng)物模型的選擇為：35日齡的圩豬、皖南黑豬、霍壽黑豬及大白豬28日齡 斷奶仔豬分別選擇76、95、153、174頭，其中圩豬采自廣德安徽安泰農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，皖 南黑豬采自績(jī)溪安徽豐潤(rùn)生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，霍壽黑豬采自霍邱安徽浩宇牧業(yè)有限公 司，大白豬采自肥東安徽安泰農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。
[0019] 本發(fā)明所述的安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其中，所述步驟 (2) 中耳樣組織采集過程為：提前在1. 5mL的Eppendorf管中注入70%體積分?jǐn)?shù)濃度的酒 精，然后每頭豬采耳組織塊約1. 5g，裝入所述Eppendorf管中，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0020] 本發(fā)明所述的安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其中，所述步驟 (3) 中耳樣組織DNA提取過程為：①用眼科剪剪取0.2g耳組織，去除其表面毛發(fā)及酒精，裝 入1. 5mLEppendorf管中，并盡可能將耳組織剪碎；②DNA的提取采用北京全式金生物科 技有限公司的組織DNA提取試劑盒提??；③將得到的DNA調(diào)終濃度至100ng/yL，放在2-8 攝氏度保存；④DNA純度檢測(cè)：取1yLDNA在SMA1000上測(cè)定0D260/0D280的比值（當(dāng) 0D260/0D280的比值在1. 8-2. 0之間，說明所提DNA純度較高）；⑤質(zhì)量檢測(cè)：將所提DNA用 1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察提取產(chǎn)物的質(zhì)量，以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0021] 本發(fā)明所述的安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其中，所述步驟 (4) 中PCR擴(kuò)增目的片段的過程為：以步驟（3)獲得的耳組織樣DNA為模板，根據(jù)GenBank 豬TAPI基因（登錄號(hào)BX323833. 4)外顯子1和外顯子8序列，采用PrimerPremier5. 0 軟件設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行TAPI基因外顯子1和外顯子8部分序列的克隆，并采用2%瓊脂糖凝膠 電泳檢測(cè)克隆產(chǎn)物是否為目的片段；其中引物TAPIexon-1的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO: 1和SEQIDNO: 2所示，引物TAPIexon-8的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO: 3和 SEQIDN0:4所示，退火溫度及目的片段長(zhǎng)度見表1。
[0022] 本發(fā)明所述的安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其中，所述步驟 (5) 中目的片段單鏈構(gòu)象多態(tài)性的過程為：先將所述TAP1基因外顯子1、8擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行非 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后進(jìn)行硝酸銀染色后用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果得到所述 斷奶仔豬TAP1基因單鏈構(gòu)象多態(tài)性。
[0023] 其中，所述非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳具體包括如下步驟：
[0024] (a)清洗制膠所用的玻璃板、夾子、軟繩、樣品梳等用具，晾干；
[0025] (b)制板：將干凈且干燥的底板磨面朝上（磨砂玻璃邊的圓頭朝下），用軟繩封住 玻璃板的三面，夾子夾緊；
[0026] ((：)配制10%的聚丙烯酰胺凝膠721^(雙蒸水421^，30%的？46￡241^，10\丁8￡ 6mL，TEMED50yL，AP330yL)，混勻后快速灌膠；
[0027] (d)將膠灌至玻璃板的邊緣處后，插入梳子（此時(shí)注意檢查膠中是否有氣泡），在 室溫下放置，待膠聚合后使用；
[0028] (e)凝膠聚合好后，向電泳槽中加入1XTBE，去下夾子、軟繩及梳子，將玻璃板固 定于電泳槽上，并用注射器沖洗加樣孔；
[0029] (f)300V電壓下預(yù)電泳 30min;
[0030] (g)取3yLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物至96孑LPCR板中，加入7yL上樣緩沖液，用槍吹打混勻 后，用透明膠帶封口；
[0031] (h)98°C變性lOmin，然后迅速冰浴lOmin，然后點(diǎn)樣；
[0032] (i)240V電壓電泳lh，150V電壓電泳12h;
[0033] 其中，所述硝酸銀染色具體包括如下步驟：
[0034] (a)電泳完成后，取下玻璃板，小心取出凝膠并做好標(biāo)記，用雙蒸水漂洗2遍；
[0035] (b)倒入固定液（10%乙醇，0? 5%乙酸）輕微振蕩5min，回收固定液；
[0036] (c)倒入2%硝酸銀溶液避光輕微振蕩15min，回收硝酸銀溶液；
[0037] (d)用蒸餾水漂洗2遍后，倒入顯色液（3%NaOH，0?1 %HCHO)振蕩進(jìn)行顯色反應(yīng)， 至條帶清晰為止；
[0038] (e)蒸餾水漂洗，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。
[0039] 本發(fā)明所述的安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其中，所述步驟 (6) 中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測(cè)序的過程為：根據(jù)單鏈構(gòu)象多態(tài)性結(jié)果，挑選不同帶型的樣本， 每種帶型挑選3個(gè)樣本，PCR擴(kuò)增50yL體系送至上海生工有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié) 果用DNAStar或DNAMan，Chromas軟件分析。
[0040] 本發(fā)明所述的安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其中，所述步驟 (7) 中群體遺傳學(xué)特性分析過程為：采用popgene軟件對(duì)步驟（5)、（6)檢測(cè)到的SNP位點(diǎn) 進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，包括等位基因頻率、基因型頻率、純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)、 多態(tài)信息含量的計(jì)算，并用卡方檢驗(yàn)來判斷群體中基因型的分布是否處于Hardy-Weinberg 平衡、采用popgene軟件進(jìn)行x2適合性檢驗(yàn)計(jì)算。
[0041] 本發(fā)明所述的安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其中，所述步驟 (8) 中仔豬血清免疫指標(biāo)的測(cè)定過程為：35日齡斷奶仔豬空腹前腔靜脈采血，常規(guī)分離血 清，使用豬ELISA試劑盒測(cè)定免疫指標(biāo)，在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)質(zhì)量濃度分別為1000pg/ml、 500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62. 5pg/ml、31. 25pg/ml、15. 6pg/ml共7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 的吸光度，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定首檢樣本的濃度；進(jìn)而計(jì)算血清中IL-6、IL-10、IL-12、 IFN-y、TNF_a的濃度。
[0042] 本發(fā)明所述的安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其中，所述步驟 (9)中采用的數(shù)學(xué)分析模型為：①品種間血清免疫指標(biāo)的差異性分析采用SPSS19. 0統(tǒng)計(jì)軟 件One-wayANOVA程序進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以"平均數(shù)土SD"表 示。②不同基因型對(duì)各免疫指標(biāo)的效應(yīng)差異分析采用的數(shù)學(xué)模型為：YU=y+Bi+G，％.;其 中，為免疫指標(biāo)表型值；y為群體均值；Bi表示斷奶仔豬的斷奶批次效應(yīng)；G」表示第j種 基因型效應(yīng)；表示隨機(jī)誤差；采用SPSS19. 0統(tǒng)計(jì)軟件GLM程序?qū)Ρ驹囼?yàn)所檢測(cè)到的遺傳 變異與血清免疫指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。
[0043] 本發(fā)明安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在 于：
[0044] 本發(fā)明所述方法以安徽省三個(gè)本地豬種（圩豬、霍壽黑豬、皖南黑豬）和一個(gè)外來 豬種大白豬為試驗(yàn)對(duì)象，利用克隆、測(cè)序的方法檢測(cè)在該四個(gè)群體TAP1基因外顯子1、8序 列區(qū)的遺傳變異。通過測(cè)定易感染F18大腸桿菌的斷奶培育時(shí)期仔豬的血清免疫指標(biāo)（血 清IL-6、IL-10、IL-12、IFN-y、TNF-a含量），進(jìn)行品種間的差異分析、以及基因型間的關(guān) 聯(lián)性分析，探討斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)在不同品種間的差異以