產(chǎn)生IL-2，IFNy等，而后者主要產(chǎn)生IL-10 等，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，并參與體液免疫。IL-12的作用是獨(dú)立誘導(dǎo)早期輔助性T母細(xì)胞 分化成Thl細(xì)胞，并且促進(jìn)Thl細(xì)胞的發(fā)育以及增殖，是介導(dǎo)Thl細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵性細(xì) 胞因子。IL-12可刺激NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生IFNy。IFNy可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的一 氧化氮，直接殺死病原菌。TNF-a可介導(dǎo)NF-kB的激活，而NF-kB作為一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因 子，可以調(diào)控促炎細(xì)胞因子、趨化因子和黏附因子等基因的活化和表達(dá)。IL-10由Th2細(xì)胞 產(chǎn)生，IL-10幾乎可以抑制如IL-6等所有炎性免疫指標(biāo)的合成與釋放，其中IL-12促進(jìn)Thl 細(xì)胞分化及增殖的能力也可以被IL-10抑制。但同時(shí)，Th2細(xì)胞的反應(yīng)及細(xì)胞因子的分泌 能力也反過(guò)來(lái)會(huì)被作為啟動(dòng)和維持Thl細(xì)胞的關(guān)鍵性細(xì)胞因子IL-12所抑制。因此，IL-10 和IL-12的動(dòng)態(tài)平衡可直接關(guān)系到Thl/Th2的動(dòng)態(tài)平衡，也就是直接關(guān)系到機(jī)體對(duì)疾病的 抵抗力。由此可見(jiàn)，各免疫指標(biāo)之間相互影響，相互配合，從而在機(jī)體免疫中發(fā)揮重要作用。 本試驗(yàn)各豬種群所檢測(cè)到的各項(xiàng)血清免疫指標(biāo)值均在正常值范圍內(nèi)。
[0303]TAP1基因G443A位點(diǎn)各群體不同基因型的相關(guān)性分析結(jié)果顯示于豬、大白豬、皖 南黑豬、霍壽黑豬各群體不同基因型之間免疫指標(biāo)的變化趨勢(shì)一致，即AA基因型個(gè)體的血 清免疫指標(biāo)含量高于GA、GG型個(gè)體；其中在圩豬血清IFNy、IL-6、TNFa含量指標(biāo)上，AA型 與GA型、GG型個(gè)體的差異均達(dá)到極顯著或顯著水平；在大白豬血清IFNy、IL-6、IL-10含 量指標(biāo)上，AA型與GA、GG型個(gè)體的差異均達(dá)到極顯著或顯著水平；在皖南黑豬血清TNFa、 IL-12、IL-10含量指標(biāo)上，AA型與GA、GG型個(gè)體的差異均達(dá)到極顯著或顯著水平；在霍壽 黑豬血清TNFa、IL-12、IFNy含量指標(biāo)上，AA型與GA、GG型個(gè)體的差異均達(dá)到極顯著或顯 著水平；故推測(cè)在該四個(gè)群體中，TAP1基因G443A位點(diǎn)AA型個(gè)體的抗病能力可能與GA、GG 型個(gè)體存在差異，A等位基因可能在豬對(duì)疾病的抗性上具有一定的優(yōu)勢(shì)。
[0304]TAP1基因G6297C/G6298T位點(diǎn)各群體不同基因型的相關(guān)性分析結(jié)果顯示：圩豬、 大白豬、皖南黑豬、霍壽黑豬各群體不同基因型之間免疫指標(biāo)的變化趨勢(shì)一致，即EE基因 型個(gè)體的血清免疫指標(biāo)含量高于EF型個(gè)體；其中在圩豬血清IFNy、TNFa含量指標(biāo)上，EE 型與EF型個(gè)體的差異達(dá)到顯著水平；在大白豬血清IFNy、IL-6、IL-10含量指標(biāo)上，EE型 與EF型個(gè)體的差異均達(dá)到極顯著或顯著水平；在皖南黑豬血清TNFa、IL-12、IL-10含量指 標(biāo)上，EE型與EF型個(gè)體的差異均達(dá)到極顯著或顯著水平；在霍壽黑豬血清TNFa、IL-12、 IL-10含量指標(biāo)上，EE型與EF型個(gè)體的差異均達(dá)到極顯著或顯著水平；故推測(cè)在該四個(gè)群 體中，TAP1基因G6297C/G6298T位點(diǎn)EE型個(gè)體的抗病能力可能與EF型個(gè)體存在差異，E等 位基因可能在豬對(duì)疾病的抗性上具有一定的優(yōu)勢(shì)。
[0305] 研宄結(jié)果提示，TAP1基因G443A、G6297C/G6298T位點(diǎn)均可作為候選靶位點(diǎn)應(yīng)用于 安徽地方豬種圩豬、皖南黑豬、霍壽黑豬及外來(lái)品種大白豬的抗病育種。
[0306] 以上所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范 圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方 案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其特征在于：包括如下步 驟： (1) 對(duì)照動(dòng)物模型的選擇：選擇安徽省地方豬種圩豬、皖南黑豬、霍壽黑豬與外來(lái)豬種 大白豬28日齡斷奶的仔豬為研宄免疫指標(biāo)品種差異的對(duì)照動(dòng)物模型； (2) 樣品采集：仔豬35日齡時(shí)，采集耳樣組織并空腹采血； (3) 耳樣組織DNA提??； (4) PCR擴(kuò)增抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體1即TAPl基因目的片段； (5) 目的片段單鏈構(gòu)象多態(tài)性即SSCP分析； (6) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測(cè)序； (7) 群體遺傳學(xué)特性分析； (8) 仔豬血清免疫指標(biāo)的測(cè)定； (9) 采用數(shù)學(xué)模型分析所檢測(cè)到的TAPl基因的遺傳變異與血清免疫指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性，并 分析品種間血清免疫指標(biāo)的差異性； 根據(jù)TAPl基因單核苷酸多態(tài)性即singlenucleotidepolymorphism:SNP與免疫指標(biāo) 的關(guān)聯(lián)性分析，探討所檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)對(duì)不同豬群斷奶仔豬抗病性的指標(biāo)是否有影響， 從而判定所檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)能否作為仔豬抗病育種的有效標(biāo)記位點(diǎn)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其特征在 于，所述步驟（1)中所述對(duì)照動(dòng)物模型的選擇為：35日齡的圩豬、皖南黑豬、霍壽黑豬及大 白豬28日齡斷奶仔豬分別選擇76、95、153、174頭，其中圩豬采自廣德安徽安泰農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有 限公司，皖南黑豬采自績(jī)溪安徽豐潤(rùn)生態(tài)農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，霍壽黑豬采自霍邱安徽浩宇 牧業(yè)有限公司，大白豬采自肥東安徽安泰農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其特征在 于，所述步驟（2)中耳樣組織采集過(guò)程為：提前在I. 5mL的Eppendorf管中注入70%體積 分?jǐn)?shù)濃度的酒精，然后每頭豬采耳組織塊I. 5g，裝入所述Eppendorf管中，于-20°C保存?zhèn)?用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其特征在 于，所述步驟（3)中耳樣組織DNA提取過(guò)程為：①用眼科剪剪取0.2g耳組織，去除其表面 毛發(fā)及酒精，裝入I. 5mLEppendorf管中，并盡可能將耳組織剪碎；②DNA的提取采用北京 全式金生物科技有限公司的組織DNA提取試劑盒提?。虎蹖⒌玫降腄NA調(diào)終濃度至IOOng/ yL，放在2-8攝氏度保存；④DNA純度檢測(cè)：取IyLDNA在SMA1000上測(cè)定0D260/0D280 的比值，當(dāng)0D260/0D280的比值在1. 8-2. 0之間，說(shuō)明所提DNA純度較高；⑤質(zhì)量檢測(cè)：將所 提DNA用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察提取產(chǎn)物的質(zhì)量，以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其特征在 于，所述步驟（4)中PCR擴(kuò)增目的片段的過(guò)程為：以步驟（3)獲得的耳組織樣DNA為模板， 根據(jù)GenBank豬TAPl基因外顯子1和外顯子8序列，其登錄號(hào)為BX323833. 4,采用Primer Premier5. 0軟件設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行TAPl基因外顯子1和外顯子8部分序列的克隆，并采用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)克隆產(chǎn)物是否為目的片段；其中引物TAPlexon-I的核苷酸序列如 序列表中SEQIDNO: 1和SEQIDNO:2所示，引物TAPlexon-8的核苷酸序列如序列表中 SEQIDNO: 3和SEQIDNO:4所示，退火溫度及目的片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。 表1豬TAPl基因引物序列6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其特征在 于，所述步驟（5)中目的片段單鏈構(gòu)象多態(tài)性的過(guò)程為：先將所述TAPl基因外顯子1、8擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后進(jìn)行硝酸銀染色后用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳 結(jié)果得到所述斷奶仔豬TAPl基因單鏈構(gòu)象多態(tài)性； 其中，所述非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳具體包括如下步驟： (a) 清洗制膠所用的玻璃板、夾子、軟繩、樣品梳等用具，晾干； (b) 制板：將干凈且干燥的底板磨面朝上，磨砂玻璃邊的圓頭朝下，用軟繩封住玻璃板 的三面，夾子夾緊； (。）配制10%的聚丙烯酰胺凝膠721^，雙蒸水421^，30%的？六6￡2411^，10\了8￡61^，TEMED50yL，AP330yL，混勻后快速灌膠； (d) 將膠灌至玻璃板的邊緣處后，插入梳子，此時(shí)注意檢查膠中是否有氣泡，在室溫下 放置，待膠聚合后使用； (e) 凝膠聚合好后，向電泳槽中加入IXTBE，去下夾子、軟繩及梳子，將玻璃板固定于 電泳槽上，并用注射器沖洗加樣孔； (f) 300V電壓下預(yù)電泳30min; (g) 取3yLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物至96孔PCR板中，加入7yL上樣緩沖液，用槍吹打混勻后， 用透明膠帶封口； (h) 98°C變性lOmin，然后迅速冰浴lOmin，然后點(diǎn)樣； (i) 240V電壓電泳lh，150V電壓電泳12h; 其中，所述硝酸銀染色具體包括如下步驟： (a) 電泳完成后，取下玻璃板，小心取出凝膠并做好標(biāo)記，用雙蒸水漂洗2遍； (b) 倒入固定液，所述固定液為含10%體積分?jǐn)?shù)乙醇和0. 5%體積分?jǐn)?shù)乙酸的雙蒸水 溶液，輕微振蕩5min，回收固定液； (c) 倒入2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硝酸銀溶液避光輕微振蕩15min，回收硝酸銀溶液； (d) 用蒸餾水漂洗2遍后，倒入顯色液，所述顯色液為含3%體積分?jǐn)?shù)NaOH和0. 1 %體 積分?jǐn)?shù)HCHO的雙蒸水溶液，振蕩進(jìn)行顯色反應(yīng)，至條帶清晰為止； (e) 蒸餾水漂洗，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其特征在 于，所述步驟(6)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測(cè)序的過(guò)程為：根據(jù)單鏈構(gòu)象多態(tài)性結(jié)果，挑選不同 帶型的樣本，每種帶型挑選3個(gè)樣本，PCR擴(kuò)增50yL體系送至上海生工有限公司進(jìn)行雙向 測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAStar或DNAMan，Chromas軟件分析。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其特征在 于，所述步驟（7)中群體遺傳學(xué)特性分析過(guò)程為：采用popgene軟件對(duì)步驟（5)、（6)檢測(cè) 到的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，包括等位基因頻率、基因型頻率、純合度、雜合度、有 效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量的計(jì)算，并用卡方檢驗(yàn)來(lái)判斷群體中基因型的分布是否處于 Hardy-Weinberg平衡、采用popgene軟件進(jìn)行X2適合性檢驗(yàn)計(jì)算。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其特征在 于，所述步驟（8)中仔豬血清免疫指標(biāo)的測(cè)定過(guò)程為：35日齡斷奶仔豬空腹前腔靜脈采血， 常規(guī)分離血清，使用豬ELISA試劑盒測(cè)定免疫指標(biāo)，在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)質(zhì)量濃度分別為 1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62. 5pg/ml、31. 25pg/ml、15. 6pg/ml共 7 個(gè)濃度 的標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定首檢樣本的濃度；進(jìn)而計(jì)算血清中IL-6、IL-10、 IL-12、IFN-y、TNF_a的濃度。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，其特征 在于，所述步驟（9)中采用的數(shù)學(xué)分析模型為：①品種間血清免疫指標(biāo)的差異性分析采用 SPSS19. 0統(tǒng)計(jì)軟件One-wayANOVA程序進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以 "平均數(shù)土SD"表示；②不同基因型對(duì)各免疫指標(biāo)的效應(yīng)差異分析采用的數(shù)學(xué)模型為=Yij = y+Bi+Gj+ey其中，Yij為免疫指標(biāo)表型值；y為群體均值；Bi表示斷奶仔豬的斷奶批次效 應(yīng)；表示第j種基因型效應(yīng)；eu表示隨機(jī)誤差；采用SPSS19. 0統(tǒng)計(jì)軟件GLM程序?qū)Ρ驹?驗(yàn)所檢測(cè)到的遺傳變異與血清免疫指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種安徽地方豬種抗病性狀候選遺傳標(biāo)記的篩選方法，包括如下步驟：(1)選擇對(duì)照動(dòng)物模型；(2)樣品采集；(3)耳組織DNA提?。?4)PCR擴(kuò)增TAP1基因目的片段；(5)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析；(6)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測(cè)序；(7)群體遺傳學(xué)特性分析；(8)血清免疫指標(biāo)的測(cè)定；(9)用數(shù)學(xué)模型分析所檢測(cè)到的TAP1基因遺傳變異與血清免疫指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性，并分析品種間血清免疫指標(biāo)的差異性。旨在尋找與安徽地方豬種抗病性狀相關(guān)的有效遺傳標(biāo)記，為安徽地方豬種質(zhì)資源特性及抗病育種研究提供分子生物學(xué)參考。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN104962616
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510308935
【發(fā)明人】丁月云, 殷宗俊, 薛瑋瑋, 朱衛(wèi)華, 張曉東, 黃龍, 陳偉平, 丁沖, 張威, 吳濤, 朱樹(shù)嬌
【申請(qǐng)人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年10月7日
【申請(qǐng)日】2015年6月5日