一種純化蛋白質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明一般涉及一種純化蛋白質(zhì)的方法。更特別地，本發(fā)明涉及一種從同一起始原料純化觸珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白的方法，及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]溶血的特征在于紅細(xì)胞破壞，并且是與紅細(xì)胞異常相關(guān)的貧血病癥的性質(zhì)標(biāo)志(hall-mark)，比如酶缺陷、血紅蛋白病、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿癥和棘突紅細(xì)胞(spur cell)貧血，以及外源因素比如脾腫大、自身免疫性病癥(例如，新生兒溶血病)、遺傳性疾病(例如，鐮狀細(xì)胞病或G6H)缺失癥)、微血管病性溶血、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌感染(例如，鏈球菌、腸道球菌和葡萄球菌)、寄生蟲(chóng)感染(例如，瘧原蟲(chóng))、毒素和創(chuàng)傷(例如燒傷)。溶血也是一種常見(jiàn)的輸血病癥，特別是大量輸血和在使用體外心肺維持的患者中。
[0003]患有與溶血相關(guān)病癥的患者中可見(jiàn)的副作用主要?dú)w因于從紅細(xì)胞釋放鐵和含鐵化合物，比如血紅蛋白(Hb)和血紅素。在生理?xiàng)l件下，釋放的血紅蛋白被可溶性蛋白質(zhì)比如觸珠蛋白結(jié)合，并轉(zhuǎn)運(yùn)到巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞。然而，當(dāng)溶血發(fā)生率加快且事實(shí)上變成病理性時(shí)，觸珠蛋白的緩沖能力被壓倒。因此，血紅蛋白被快速氧化成鐵血紅蛋白，其依次釋放游離血紅素(包含原卟啉IX和鐵)。雖然血紅素在一些生物進(jìn)程中起決定作用(例如，作為必需蛋白質(zhì)比如血紅蛋白和肌紅蛋白的一部分)，但是游離血紅素是高毒性的。游離血紅素是氧化還原活性鐵的來(lái)源，其產(chǎn)生損害類脂膜、蛋白質(zhì)和核苷酸的高毒性活性氧種類(ROS)。血紅素的毒性由于其插入類脂膜的能力而進(jìn)一步加劇，在類脂膜中血紅素引起膜組分氧化且促進(jìn)細(xì)胞溶解和死亡。
[0004]在生理學(xué)穩(wěn)態(tài)條件下和在輕度溶血期間，連續(xù)低水平細(xì)胞外Hb/血紅素暴露的進(jìn)化壓力導(dǎo)致控制游離Hb/血紅素副作用的補(bǔ)償機(jī)制。這些系統(tǒng)包括釋放一組結(jié)合Hb或血紅素的血漿蛋白，包括Hb清除劑觸珠蛋白(Hp)和血紅素清除劑蛋白質(zhì)血紅素結(jié)合蛋白(Hx)和α -1微小球蛋白。然而，雖然在生理學(xué)穩(wěn)態(tài)條件下，內(nèi)源性Hp和Hx控制游離Hb/血紅素的副作用，但是它們?cè)诓±砩韺W(xué)條件(比如與溶血相關(guān)的那些條件)下保持穩(wěn)態(tài)Hb/血紅素水平的功效很小。
[0005]本發(fā)明提供一種從同一起始原料純化Hp和Hx的方法。所述純化的蛋白質(zhì)可用于治療與溶血和Hb/血紅素水平異常相關(guān)的病癥的組合物中。
[0006]發(fā)明簡(jiǎn)述
[0007]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種從含有觸珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白兩種蛋白質(zhì)的溶液中純化這兩種蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括:
[0008](i)提供含有觸珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白兩者的溶液；
[0009](ii)通過(guò)向溶液中加入硫酸銨從所述溶液中沉淀觸珠蛋白；
[0010](iii)從含有血紅素結(jié)合蛋白的溶液中分離沉淀的觸珠蛋白；和
[0011](iv)以一個(gè)或多個(gè)步驟分別純化觸珠蛋白和/或血紅素結(jié)合蛋白。
[0012]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種包含通過(guò)本文公開(kāi)的方法回收的觸珠蛋白的組合物。
[0013]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種包含通過(guò)本文公開(kāi)的方法回收的血紅素結(jié)合蛋白的組合物。
[0014]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種包含通過(guò)本文公開(kāi)的方法回收的轉(zhuǎn)鐵蛋白的組合物。
[0015]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種包含通過(guò)本文公開(kāi)的方法回收的觸珠蛋白和通過(guò)本文公開(kāi)的方法回收的血紅素結(jié)合蛋白的組合物。
[0016]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種包含含量為總蛋白的至少95%的觸珠蛋白的組合物。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種包含含量為總蛋白的至少80%的血紅素結(jié)合蛋白的組合物。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種包含含量為總蛋白的至少80%的組合的血紅素結(jié)合蛋白和觸珠蛋白的組合物。
[0017]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種包含如本文公開(kāi)的本發(fā)明的組合物和可藥用載體的制劑。
[0018]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種治療與溶血相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用如本文公開(kāi)的本發(fā)明的組合物或制劑。
[0019]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供如本文公開(kāi)的本發(fā)明的組合物或制劑在制備用于治療與溶血相關(guān)的病癥的藥物中的用途。
[0020]附圖簡(jiǎn)述
[0021]圖1為Cohn分級(jí)過(guò)程的流程圖。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到改變圖1中描述的過(guò)程參數(shù)(例如，pH、乙醇濃度、溫度等)也可以應(yīng)用于產(chǎn)生Cohn級(jí)分。
[0022]圖2顯示在2.0M,2.5M、3.0M,3.5M和4.0M硫酸銨的存在下沉淀之后，剩余濾液中轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、白蛋白(Alb)、血紅素結(jié)合蛋白(HPX)和觸珠蛋白(HAP)的回收。
[0023]圖3顯示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DOE)的需要性圖，顯示從血漿級(jí)分中沉淀觸珠蛋白而使血紅素結(jié)合蛋白保留在溶液中所期望的條件。DOE是一組用于評(píng)價(jià)pH和硫酸銨濃度對(duì)從觸珠蛋白分離血紅素結(jié)合蛋白的能力的影響的控制實(shí)驗(yàn)。使用因子數(shù)學(xué)設(shè)計(jì)來(lái)設(shè)計(jì)和分析數(shù)據(jù)。圖3中描繪的需要性圖使用該數(shù)學(xué)設(shè)計(jì)來(lái)決定應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生血紅素結(jié)合蛋白和觸珠蛋白兩者的最佳分離和回收的最期望條件。
[0024]圖4顯示在本文公開(kāi)的純化方法的各種步驟之后回收的血紅素結(jié)合蛋白的SDS-PAGE電泳。使用預(yù)制的10% Tris-甘氨酸凝膠(Novex, EC6075)進(jìn)行SDS-PAGE分析。將所有樣品都在Tri S-甘氨酸SDS樣品緩沖液(LC2676)中稀釋成0.lmg/mL的濃度，并且將20 μ L的每種樣品裝入凝膠的樣品孔中。運(yùn)行時(shí)間和電壓設(shè)置為凝膠制造商的建議值(恒定125V)。用易于使用類型的考馬斯亮藍(lán)染色溶液(Novex，Simply BlueSafestain, LC6065)對(duì)每個(gè)凝膠染色。泳道I (LMWS)含有Novex靈敏未染色標(biāo)準(zhǔn)品(NovexSharp Unstained Protein Standards)，LC580I。
[0025]圖5顯示在本文公開(kāi)的純化方法的各種步驟之后回收的觸珠蛋白中間體的SDS-PAGE電泳(使用圖4中上述的方法)。泳道2中的觸珠蛋白標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)自Benesis(T043HPX)。
[0026]圖6顯示Capto Q洗脫液在10 % Tris-甘氨酸未還原SDS-PAGE電泳凝膠(使用圖4中描述的方法)上的蛋白質(zhì)印跡。然后，將單獨(dú)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜，并阻斷該膜防止任何非特異性抗體結(jié)合。然后，用含有人觸珠蛋白抗體(兔子抗-人觸珠蛋白Sigma H8636)的溶液培養(yǎng)硝基纖維素膜。然后，用硝基纖維素膜(山羊抗-兔子HRP，SigmaA6154)培養(yǎng)與辣根過(guò)氧化酶(HRP)連接的二級(jí)抗體。接著，用含有過(guò)氧化物的溶液展開(kāi)硝基纖維素，由此僅顯影特別地含有人觸珠蛋白的蛋白質(zhì)帶。泳道含有不同濃度的CaptoQ ImpRes Eluate (T0209001)(泳道 2-1:10 稀釋，0.lmg/mL，20 μ L 負(fù)載；泳道 3-1:20 ;泳道4-1:40 ;泳道 5-1:80 ;泳道 6-1:160 ;泳道 7-1:320 ;泳道 8-1:640 ;泳道 9-1:1280 ;和泳道10-1:2560)。蛋白質(zhì)印跡表明Capto Q Eluate中存在大部分條帶是觸珠蛋白。
[0027]圖7顯示在本文公開(kāi)的純化方法的各種步驟之后從離子交換層析(Capto DEAE)回收的轉(zhuǎn)鐵蛋白的SDS-PAGE電泳(使用圖4中描述的方法)。峰I (泳道4)載荷重，但是似乎是純轉(zhuǎn)鐵蛋白(與泳道2，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，Sigma Τ8158比較)。這表明從辛基瓊脂糖沖洗物(Octyl Sepharose Wash)級(jí)分純化轉(zhuǎn)鐵蛋白是可能的，其也意味著從同一起始原料純化血紅素結(jié)合蛋白、觸珠蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白是可能的。
[0028]圖8顯示在本文公開(kāi)的純化方法期間來(lái)自離子交換色譜柱的轉(zhuǎn)鐵蛋白線性梯度的色譜圖。在圖7中，通過(guò)SDS-PAGE分析標(biāo)記I至4的峰。
[0029]圖9為根據(jù)本文公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方案的血紅素結(jié)合蛋白純化方法的流程圖。
[0030]圖10為根據(jù)本文公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方案的觸珠蛋白純化方法的流程圖。
[0031]圖11為根據(jù)本文公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方案的組合觸珠蛋白/血紅素結(jié)合蛋白/轉(zhuǎn)鐵蛋白純化方法的流程圖。
[0032]詳細(xì)說(shuō)明
[0033]在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，除非上下文另外要求，否則措辭〃包括〃或其變化比如〃包括〃或"包含"應(yīng)當(dāng)理解為意味著包含所述要素或整數(shù)或要素組或整數(shù)組，但不排除任何其它要素或整數(shù)或要素組或整數(shù)組。
[0034]在本說(shuō)明書(shū)中參考的任何現(xiàn)有出版物(或來(lái)源于其的信息)或其中任何物質(zhì)都是已知的，不會(huì)且不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或認(rèn)可或以任何形式暗示該現(xiàn)有出版物(或來(lái)源于其的信息)或已知物質(zhì)構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)相關(guān)的努力領(lǐng)域的普通常識(shí)部分。
[0035]必須指出，除非上下文另有清楚的規(guī)定，否則如本說(shuō)明書(shū)中使用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”或“所述”包括復(fù)數(shù)方面。因此，例如提及“一種樹(shù)脂”包括單個(gè)樹(shù)脂，以及兩種或多種樹(shù)脂；提及“組合物”包括單一組合物，以及兩種或多種組合物；諸如此類。
[0036]在不存在任何相反指示下，在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中提及“ ％ ”含量應(yīng)當(dāng)視為平均％ w/w (重量/重量)。例如，包含含量為總蛋白的至少95%的觸珠蛋白的溶液意味著指包含含量為總蛋白的至少95% w/w的觸珠蛋白的組合物。
[0037]本發(fā)明至少部分地基于發(fā)現(xiàn)了可以從同一起始原料純化觸珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種從含有觸珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白兩種蛋白質(zhì)的溶液中純化這兩種蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括:
[0038](i)提供含有觸珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白兩者的溶液；
[0039](ii)通過(guò)向該溶液中加入硫酸錢從所述溶液中沉淀觸珠蛋白；
[0040](iii)從含有血紅素結(jié)合蛋白的該溶液中分離沉淀的觸珠蛋白；和
[0041](iv)以一個(gè)或多個(gè)步驟分別純化觸珠蛋白和/或血紅素結(jié)合蛋白。
[0042]觸珠蛋白(Hp)是一種由成人的肝合成且分泌到血漿中四鏈(α2β)糖蛋白。Hp的前肽形式被蛋白酶切割成α-鏈和β-鏈。然后，Hp蛋白的兩個(gè)α-亞基和兩個(gè)β-亞基通過(guò)鏈間二硫鍵結(jié)合，形成成熟肽，其可以是(α β)_ 二聚體或(α β)_多聚體。血紅素結(jié)合蛋白(Hx)是一個(gè)包含單一 439個(gè)氨基酸長(zhǎng)肽鏈的60-kD血漿β-1B-糖蛋白，其形成由結(jié)構(gòu)域間連接基結(jié)合的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。其對(duì)于任何表征的血紅素-結(jié)合蛋白的血紅素都具有已知最高的親和力(KcKlpM)，并且以結(jié)構(gòu)域間連接基形成的口袋內(nèi)Hx的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的等摩爾比結(jié)合血紅素。
[0043]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)濃度在約2.0M至約2.5Μ范圍內(nèi)，優(yōu)選地在約2.2Μ至約2.5Μ范圍內(nèi)，更優(yōu)選約2.4Μ的硫酸銨對(duì)于從同一起始原料分離兩種蛋白質(zhì)是最佳的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)向溶液中加入約2.0M至約2.5Μ的硫酸銨從所述溶液中沉淀觸珠蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)向溶液中加入約2.2Μ至約2.5Μ的硫酸銨從所述溶液中沉淀觸珠蛋白。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括通過(guò)向溶液中加入約2.4Μ的硫酸銨從所述溶液中沉淀觸珠蛋白。在特定實(shí)施方案中，硫酸銨的濃度為2.0M或 2.1M 或 2.2Μ 或 2.3Μ 或 2.4Μ 或 2.5Μ。
[0044]本發(fā)明人還表明對(duì)于從同一起始原料分離兩種蛋白質(zhì)而言，維持在小于或等于約8的范圍、優(yōu)選約6到約8、更優(yōu)選約7的pH是最佳的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在小于或等于8的pH從溶液中沉淀觸珠蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在約6至約8范圍內(nèi)的pH從溶液中沉淀觸珠蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方