具有導(dǎo)電率小于6.0mS/cm的50mM乙酸鈉。其它實施方案利用pH約5至約6的約10至約40mM乙酸鈉。
[0066]其它實施方案包括通過加入水(比如注射用水(WFI))稀釋觸珠蛋白負(fù)載溶液以降低離子強度。例如，用WFI進行1:4至1:5稀釋，包含pH 5.3-5.7的50mM乙酸鈉的觸珠蛋白溶液將具有約10-13mM的最終乙酸鈉濃度、pH 5.3至5.7和小于5.0mS/cm的導(dǎo)電率。這通常允許觸珠蛋白結(jié)合陰離子交換色譜樹脂。
[0067]如果需要pH調(diào)節(jié)超出觸珠蛋白溶液中緩沖劑的緩沖范圍，則可以向觸珠蛋白溶液中加入另外的緩沖劑。另外的緩沖劑通常具有約5mM至約10mM的濃度和范圍約5至約9的pH。在特定實施方案中，另外的緩沖劑應(yīng)當(dāng)在約1mM至約60mM的范圍內(nèi)，pH范圍為約5至約9。另外的緩沖劑的一個實例是乙酸鈉。特定實施方案利用pH范圍5.0至6.0的50mM乙酸鈉。在一個優(yōu)選的實施方案中，緩沖劑為pH范圍pH 5.3至pH 5.7的50mM乙酸鈉。
[0068]適于從樹脂中洗脫觸珠蛋白的緩沖液也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在特定實施方案中，合適的緩沖劑具有約5mM至約10mM范圍內(nèi)的濃度。在特定實施方案中，緩沖劑具有的濃度范圍為約1mM至約60mM。一個實例包括乙酸鈉。特定實施方案利用pH 5.0至6.0的50mM乙酸鈉。其它實施方案利用pH約5.0至約6.0的約10至約40mM乙酸鈉。在一個優(yōu)選的實施方案中，緩沖劑為PH為約pH 5.3至約pH 5.7的約50mM乙酸鈉。
[0069]在進一步的實施方案中，觸珠蛋白是用包含約10mM至約200mMNaCl的洗脫緩沖液從陰離子交換樹脂洗脫的。這等同于具有導(dǎo)電率范圍約10mS/cm(100mM NaCl)至約18mS/cm(200mM NaCl)的洗脫緩沖液。在特定實施方案中，在約150至170mM NaCl的存在下洗脫觸珠蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中，在約160mM NaCl的存在下洗脫觸珠蛋白。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道洗脫緩沖液的NaCl濃度將取決于應(yīng)用于柱的蛋白質(zhì)負(fù)載，為了獲得從樹脂洗脫的觸珠蛋白的必要的回收率和純度，可能需要超出所述限度的調(diào)節(jié)。
[0070]在一個實施方案中，回收洗脫的觸珠蛋白并分別貯存?zhèn)溆?。在另一個實施方案中，根據(jù)需要，例如通過濃縮和滲濾洗脫的觸珠蛋白穿過超濾膜和/或無菌過濾濃縮的和/或滲濾的觸珠蛋白來進一步純化洗脫的觸珠蛋白。
[0071]在一個實施方案中，所述方法進一步包括:
[0072](i)在使血紅素結(jié)合蛋白結(jié)合樹脂的條件下，使含有血紅素結(jié)合蛋白的溶液穿過疏水性相互作用色譜樹脂；
[0073](ii)收集來自步驟⑴的流出級分；
[0074](iii)任選地在步驟(ii)之后，沖洗所述樹脂，并收集流出的沖洗級分；和
[0075](iv)在步驟(ii)之后和/或在步驟(iii)之后，從所述樹脂洗脫血紅素結(jié)合蛋白；和
[0076](V)回收洗脫的血紅素結(jié)合蛋白。
[0077]疏水性相互作用色譜法(HIC)是一種基于固定相和待分離的蛋白質(zhì)之間疏水性相互作用常常用于分離蛋白質(zhì)的色譜技術(shù)。靶蛋白的疏水性水平將通常決定了使用的HIC樹脂的類型。在HIC期間，通常向溶液中加入大量的鹽以降低靶蛋白的溶解度，因此增加了靶蛋白與被合適的疏水基(例如苯基、丁基和十八烷基)功能化的HIC樹脂的相互作用。合適的鹽通常包括硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸銨、氯化銨、氯化鈉、溴化鈉和硫氰酸鈉。合適的疏水性相互作用色譜樹脂是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。實例包括辛基瓊脂糖和capto辛基色譜樹月旨。允許血紅素結(jié)合蛋白結(jié)合樹脂的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，將例如由使用的樹脂類型和靶蛋白(即，血紅素結(jié)合蛋白)的疏水性決定。
[0078]血紅素結(jié)合蛋白負(fù)載溶液含有硫酸銨，因此，用于柱平衡的合適的緩沖液包括濃度為約5mM至約10mM的緩沖劑，其保持約6至約8的pH且含有約2至2.5M硫酸銨。這些條件允許血紅素結(jié)合蛋白結(jié)合疏水性相互作用色譜介質(zhì)。另一個實施方案利用濃度2.2至2.5M、pH7.0至8.0的硫酸銨。在一個特定實施方案中，緩沖溶液為50mM Tris，含有2.5M硫酸銨，pH 7.4ο
[0079]血紅素結(jié)合蛋白負(fù)載溶液通常含有在pH約6至約8緩沖的約2.0至約2.5M硫酸銨。這些條件允許血紅素結(jié)合蛋白結(jié)合疏水性相互作用介質(zhì)。在另一個實施方案中，血紅素結(jié)合蛋白負(fù)載溶液含有在pH 7.0至8.0緩沖的2.2M至2.5M硫酸銨。在一個特定實施方案中，血紅素結(jié)合蛋白負(fù)載溶液含有作為緩沖劑的50mM Tris和pH 7.4的2.5M硫酸銨。
[0080]一旦使含有血紅素結(jié)合蛋白的溶液通過疏水性相互作用色譜(HIC)樹脂，則可以收集流過級分并儲存?zhèn)溆茫绫疚墓_的。
[0081]結(jié)合的血紅素結(jié)合蛋白可以是利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式從樹脂洗脫的。在從樹脂洗脫血紅素結(jié)合蛋白之前，可以在使結(jié)合的血紅素結(jié)合蛋白保持在樹脂的條件下，任選地用合適的沖洗溶液或緩沖液沖洗樹脂。合適的沖洗溶液和條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。沖洗溶液的濃度在某種程度上取決于柱負(fù)載，然而典型的洗滌溶液在約6至約8的pH具有緩沖效應(yīng)，并且另外含有約0.8M至1.5M硫酸銨。在另一個實施方案中，洗滌溶液含有pH 7.0至8.0的0.9M至1.3M硫酸銨。在一個特定實施方案中，沖洗溶液含有作為緩沖劑的50mMTris、l.13M硫酸銨，pH 7.4。根據(jù)需要，也可以收集流過的沖洗級分并儲存?zhèn)溆谩?br>[0082]從樹脂回收的洗脫的血紅素結(jié)合蛋白可以儲存?zhèn)鋵硎褂?。洗脫的血紅素結(jié)合蛋白也可以進行進一步純化，以除去洗脫液中的任何雜質(zhì)。因此，在一個實施方案中，所述方法進一步包括:
[0083](i)在允許血紅素結(jié)合蛋白結(jié)合樹脂的條件下，使洗脫的血紅素結(jié)合蛋白通過金屬離子親和色譜樹脂；
[0084](ii)從所述樹脂洗脫血紅素結(jié)合蛋白；和
[0085](iii)回收洗脫的血紅素結(jié)合蛋白。
[0086]固定金屬離子親和色譜(IMAC)是基于氨基酸(例如組氨酸)共價連接金屬，允許對于金屬離子具有親和性的蛋白質(zhì)保留在含有固定金屬離子(比如鋅、鈷、鎳或銅)的柱中。合適的金屬離子親和色譜樹脂是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一個實施方案中，金屬離子親和色譜樹脂為N1-瓊脂糖(N1-Sepharose)。
[0087]適于平衡和結(jié)合的緩沖液目的是防止非特異性結(jié)合色譜介質(zhì)，且最優(yōu)地促進血紅素結(jié)合蛋白的親和性，同時使污染蛋白質(zhì)的結(jié)合降至最少。用于平衡和結(jié)合的緩沖液通常具有的pH范圍為約6至約9，并且包括加入約0.5M至約1.0M氯化鈉連同加入少量(即，I至50mM)的組氨酸或咪唑。在一些實施方案中，緩沖液由0.5mM至10mM磷酸鈉，約pH 7至約8，約0.5M至約1.0M氯化鈉和約ImM至約50mM咪唑組成。在一個特定實施方案中，平衡和結(jié)合緩沖液由20mM磷酸鈉、0.5MNaCl和30mM咪唑，pH 7.4組成。通過加入期望的固體賦形劑或加入濃縮溶液，可以將負(fù)載溶液(辛基洗脫液(Octyl Eluate))調(diào)節(jié)至這些濃度。
[0088]一旦血紅素結(jié)合蛋白結(jié)合金屬離子親和色譜(IMAC)樹脂，則可以在使結(jié)合的血紅素結(jié)合蛋白保留在樹脂的條件下，沖洗該樹脂以除去任何殘留未結(jié)合的或弱結(jié)合的雜質(zhì)。適于沖洗步驟的緩沖液在6.0至9.0的pH范圍之內(nèi)，并且包括加入0.5M至1.0M氯化鈉連同加入少量(即I至50mM)的組氨酸或咪唑。在某些實施方案中，緩沖液由約0.5mM至約10mM磷酸鈉(約pH 7至約pH 8)、與約0.5M至約1.0M氯化鈉、及約ImM至約80mM咪唑組成。在一個特定實施方案中，沖洗緩沖液由20mM磷酸鈉、0.5M NaCl和30mM咪唑、pH7.4組成。
[0089]可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式從樹脂洗脫結(jié)合的血紅素結(jié)合蛋白。適于洗脫的緩沖液具有在約6至約9的pH范圍內(nèi)，并且包括加入約0.5M至約1.0M氯化鈉連同濃度足夠高至促進洗脫的組氨酸或咪唑。在某些實施方案中，洗脫緩沖液由約0.5mM至約10mM磷酸鈉(約pH 7.0至約pH 8)、與約0.5M至約1.0M氯化鈉、及少于約80mM咪唑組成。在一個特定實施方案中，洗脫緩沖液由20mM磷酸鈉、0.5M NaCl和10mM咪唑、pH 7.4組成。可選地，通過應(yīng)用在約pH 4.0至約pH 6.0之間的低pH緩沖液，可以洗脫結(jié)合的血紅素結(jié)合蛋白。某些實施方案利用在pH為約4.0至約pH 6.0的約5mM至約10mM乙酸鈉緩沖液與約0.5M至約1.0M NaCl作為洗脫緩沖液。根據(jù)需要，例如通過濃縮和滲濾血紅素結(jié)合蛋白穿過超濾膜和/或無菌過濾該濃縮的和/或滲濾的血紅素結(jié)合蛋白，可以進一步純化洗脫的血紅素結(jié)合蛋白。
[0090]本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在硫酸銨的存在下沉淀觸珠蛋白之后，可存在于起始原料中的任何轉(zhuǎn)鐵蛋白保留在溶液中(即，包含血紅素結(jié)合蛋白的溶液中)。因此，本文公開的本發(fā)明的方法也可以用于從同一起始原料純化轉(zhuǎn)鐵蛋白。因此，提供的條件對于從同一起始原料純化所有三種蛋白質(zhì)(Hp、Hx和轉(zhuǎn)鐵蛋白)都是最佳的。因此，在一個實施方案中，含有觸珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白兩者的溶液(例如，起始原料)進一步包括轉(zhuǎn)鐵蛋白。
[0091]在一個實施方案中，所述方法進一步包括:
[0092](a)在允許血紅素結(jié)合蛋白結(jié)合樹脂的條件下，使含有血紅素結(jié)合蛋白的溶液穿過疏水性相互作用色譜樹脂；
[0093](b)收集來自步驟(a)的流出級分；
[0094](c)任選地在步驟(b)之后，沖洗所述樹脂，并收集流出的沖洗級分；
[0095](d)在使轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合樹脂的條件下，使來自步驟(b)的流過級分和/或來自步驟(C)的流過級分通過陰離子交換色譜樹脂；和
[0096](e)回收來自所述樹脂的轉(zhuǎn)鐵蛋白。
[0097]在特定實施方案中，步驟(ii)陰離子交換色譜樹脂為強陰離子交換色譜樹脂。在其它特定實施方案中，步驟(ii)的陰離子交換色譜樹脂為弱陰離子交換色譜樹脂。
[0098]合適的強陰離子交換色譜樹脂是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。合適的陰離子交換樹脂的實例為包含功能性季銨基團(Q)和/或二乙基氨基丙基基團(ANX)的陰離子交換樹脂。在一個實施方案中，強陰離子交換色譜樹脂包括功能性季銨基團(例如，Capto QImpRes?)。
[0099]合適的弱陰離子交換色譜樹脂是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。實例包括包含叔胺或仲胺官能團比如DEAE(二乙氨基乙基)的樹脂。
[0100]本領(lǐng)域技術(shù)人員也能確定，由于HIC沖洗級分的離子強度；將需要稀釋、滲濾、色譜脫鹽、或緩沖液交換/離子強度降低的其它方法以允許轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合陰離子交換樹脂。一種這樣的色譜脫鹽方法包括將含有約0.8M至約1.5M硫酸銨的HIC沖洗級分(轉(zhuǎn)鐵蛋白)直接結(jié)合在更強的疏水性配體比如苯基或丁基柱上。一旦結(jié)合，轉(zhuǎn)鐵蛋白可以洗脫在制備用于陰離子交換色譜的WFI或低離子強度緩沖液中。
[0101 ] 適于陰離子交換色譜平衡和結(jié)合的緩沖液允許轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合到陰離子交換介質(zhì)，以促進色譜分離轉(zhuǎn)鐵蛋白與其它雜質(zhì)。適于色譜介質(zhì)平衡的緩沖液具有約5mM至約10mM的濃度、約6至約9的pH范圍與小于約9.0mS/cm的導(dǎo)電率。這些條件允許轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合至陰離子交換介質(zhì)。在特定實施方案中，緩沖劑的范圍為約1mM至約60mM，pH范圍為約6至約9，導(dǎo)電率小于約7.0mS/cm。合適的緩沖劑的實例包括Tris和磷酸鈉。特定實施方案利用pH范圍為約7至約9、導(dǎo)電率小于約6.0mS/cm的50mM Tris。其它實施方案利用pH為約7.0至約9.0、導(dǎo)電率小于約5.0mS/cm的約10至約4