一種產(chǎn)dha的裂殖壺菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)DHA的裂殖壺菌基因工程菌及其 構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] DHA是一種重要的omega-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，是大腦和視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞膜 的組成成分，具有增強(qiáng)視力、促進(jìn)腦細(xì)胞發(fā)育及預(yù)防高血壓、動(dòng)脈硬化、心血管疾病等生理 功效。人體很難通過(guò)自身合成來(lái)滿足機(jī)體對(duì)DHA的需求，需要從食物中攝取。從自然界中 獲取DHA的來(lái)源很有限，采用工業(yè)化裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA，產(chǎn)量低，成本高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種高產(chǎn)DHA的裂殖壺菌基因工程菌。
[0004] 本發(fā)明的另一目的是提供所述裂殖壺菌基因工程菌的構(gòu)建方法，該方法簡(jiǎn)單，效 率高，成本較低。
[0005] 本發(fā)明的再一目的是提供采用所述裂殖壺菌基因工程菌制備DHA的方法，該方法 能夠獲得較高產(chǎn)量的DHA，成本較低。
[0006] 本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種產(chǎn)DHA的裂殖壺菌基因工程菌，是在裂殖壺菌基因組中整合有蘋果酸酶基因 的表達(dá)盒的工程菌，所述蘋果酸酶基因的表達(dá)盒依次含有啟動(dòng)子、蘋果酸酶基因和終止子。
[0008] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述啟動(dòng)子為泛素啟動(dòng)子，所述蘋果酸酶基因如SEQ ID NO: 1 所示，所述終止子為泛素終止子。所述整合位點(diǎn)為ISsrDNA。
[0009] 本發(fā)明還提供所述裂殖壺菌基因工程菌的構(gòu)建方法，構(gòu)建含有蘋果酸酶基因的表 達(dá)盒的同源重組片段；將所述同源重組片段導(dǎo)入裂殖壺菌進(jìn)行同源重組，篩選獲得所述裂 殖壺菌基因工程菌。
[0010] 在本發(fā)明中，所述同源重組片段中在所述蘋果酸酶基因的表達(dá)盒的兩端設(shè)有 18srDNA的上、下游同源臂，所述18srDNA的上游同源臂序列如SEQ ID N0:2所示，18srDNA 的下游同源臂如SEQ ID N0:3所示。
[0011] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述同源重組片段攜帶有博萊霉素抗性標(biāo)記基因。
[0012] 本發(fā)明還提供采用所述裂殖壺菌基因工程菌制備DHA的方法，采用種子培養(yǎng)基培 養(yǎng)裂殖壺菌基因工程菌，然后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基制備DHA ;所述種子培養(yǎng)基含有：葡萄糖 40g/L、酵母膏 2g/L、谷氨酸鈉 10g/L、KH2P044g/L、NaC115g/L、MgCl23g/L、CaCl 2 · 2H20 Ig/ L、KCl 2g/L、MgSO4 ·7Η20 5g/L、FeCl3O. lg/L;所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有：葡萄糖 40g/L、酵母 膏 2g/L、谷氨酸鈉 10g/L、KH2P044g/L、NaCl 15g/L、MgCl23g/L、（NH4)2S046g/L、KCl 2g/L、 MgSO4 · 7H20 5g/L、FeCl3O. lg/L。
[0013] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明將具有強(qiáng)啟動(dòng)子和蘋果酸酶基因的表達(dá)盒整合到裂殖 壺菌基因組上，構(gòu)建得到產(chǎn)DHA的裂殖壺菌基因工程菌。該基因工程菌能夠過(guò)表達(dá)蘋果酸 酶。在基因工程菌內(nèi)，蘋果酸脫氫酶能夠催化草酰乙酸為蘋果酸，過(guò)表達(dá)的蘋果酸酶能夠?qū)?蘋果酸還原成丙酮酸并生成大量的NADPH，從而使丙酮酸一草酰乙酸一蘋果酸的循環(huán)反應(yīng) 能夠進(jìn)行，此循環(huán)反應(yīng)中生成大量的NADPH，對(duì)油脂的生成有很大的促進(jìn)作用，因此本發(fā)明 基因工程菌具有較高產(chǎn)DHA的能力。本發(fā)明基因工程菌的構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，高效，成本低。本 發(fā)明采用所述裂殖壺菌基因工程菌制備DHA的方法，產(chǎn)量較原始菌株顯著提高，成本較低。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1 :質(zhì)粒PBZ-18S的構(gòu)建步驟。
[0015] 圖2質(zhì)粒pBZ18S-PMT的構(gòu)建步驟。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅限于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)該也不會(huì)限制權(quán)力要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0017] 本發(fā)明中的生物材料來(lái)源如下：
[0018] 裂殖壺菌（Schizochytrium sp. )HX_308,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，其保藏編號(hào)為 CCTCC No. M 209059 ;
[0019] 載體 pBlueScript II SK :商業(yè)載體，購(gòu)于 Invitrogen 公司；
[0020] 載體pGAPZ a A :商業(yè)載體，購(gòu)于Invitrogen公司；
[0021] 載體pMD19_T :商業(yè)載體，購(gòu)于TaKaRa公司；
[0022] 載體pMD19_T (simple):商業(yè)載體，購(gòu)于TaKaRa公司。
[0023] 實(shí)施例1重組質(zhì)粒pBZ-18S的構(gòu)建
[0024] 1.構(gòu)建重組載體pBS-Zeo
[0025] 借助BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)將pGAPZ a A載體中的Zeocin (博萊霉素）抗性基 因片段插入pBlueScript II SK載體，構(gòu)建重組載體pBS-Zeo。
[0026] pGAPZa A和pBlueScript II SK載體分別進(jìn)行雙酶切。酶切體系（相關(guān)試劑購(gòu) 自 TaKaRa) :ddH20 60 μ L，EcoRI 2 μ L，BamHI 2 μ L，10 XK buffer 10 μ L，載體 26 μ L。酶 切溫度：30 °C。
[0027] 用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，并使用Takara膠回收試劑盒純化目的 片段，再將純化的片段用T4連接酶連接過(guò)夜。
[0028] T4 連接酶體系：CldH2O 11. 5 μ L，T4 Ligase 1 μ L，T4 Ligase buffer 2. 5 μ L， Zeocin抗性基因片段8 μ L，載體2 μ L。
[0029] 取連接過(guò)夜后的反應(yīng)液5以1^加入50以1^0冊(cè)€1感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴3〇1^11，42°〇熱 激3〇8，立即置于冰上2!1^11。迅速加入25(^1^1^培養(yǎng)基，在37°0、200印111條件下培養(yǎng)111。 取200 μ L菌液涂含氨芐青霉素的LB平板，過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取10個(gè)陽(yáng)性菌落接含氨芐青霉 素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒并命名為pBS-Zeo。
[0030] 2.擴(kuò)增裂殖壺菌18SrDNA上、下游同源臂
[0031] (1)擴(kuò)增裂殖壺菌ISSrDNA上游同源臂
[0032] 采用真菌18SrDNA通用引物NSl和NS8擴(kuò)增裂殖壺菌（Schizochytrium sp.) HX-308的18SrDNA片段，將其連接到T載體上，得到重組載體PMD-18S。其中 NSl 的序列（SEQ ID N0:6)為：GTAGTCATATGCTTGTCTC，NS8 的序列（SEQ ID N0:7) 為：TCCGCAGCTTCACCTACGGA。
[0033] 根據(jù)獲得的裂殖壺菌ISSrDNA片段序列設(shè)計(jì)引物ISSupS和ISSupA擴(kuò)增上游同源 臂（SEQ ID N0:2)。18SupS(SEQ ID N0:8)序列：5' -GGGTACCCGTAGTCATATGCTTGTCTC-3'， 18SupA(SEQ ID N0:9)序列：5' -CCTCGAGGATTTCACCTCTAGCGAC-3'。
[0034] PCR 反應(yīng)體系（相關(guān)試劑購(gòu)自 TaKaRa) : PrimeSTAR? HS (Premix) 25 μ L，18SupS 0.3yL，18SupA 0.3yL，pMD-18S 0.4yL，ddH20 24 以匕？〇?反應(yīng)條件：98。〇108,65。〇158， 72°C 50s，循環(huán) 30 次；72°C 7min。
[0035] 用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并使用Takara膠回收試劑盒純化目的 片段，再將純化的片段克隆到載體？1019-1'上。克隆體系：1以1^?1?19-1'載體、4以1^純化后 的片段，輕輕混勻；25°C反應(yīng)20min后，加入50yL DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42°C熱 激3〇8，立即置于冰上2!1^11。迅速加入25(^1^1^培養(yǎng)基，在200印111、37°0條件下培養(yǎng)111。 取200 μ L菌液涂含氨芐青霉素的LB平板，過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取10個(gè)陽(yáng)性菌落接含氨芐青霉 素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送測(cè)序驗(yàn)證并命名為pMD19-18Sup。
[0036] (2)擴(kuò)增裂殖壺菌18SrDNA下游同源臂
[0037] 根據(jù)獲得的裂殖壺菌18SrDNA序列設(shè)計(jì)引物18SdownS(SEQ ID NO: 10) 和 18SdownA(SEQ ID N0:11)擴(kuò)增下游同源臂（SEQ ID N0:3)。18SdownS 序列： 5' -CGGATCCGATGCCGACTAGAGATT-3' ； 18SdownA 序列：5' -GAGCTCTCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'。
[0038] PCR 反應(yīng)體系：PrimcSTAR? HS (Premix) 25 μ L，18SdownS 0· 3 μ L，18SdownA 0· 3 μ L，PMD-18S 0· 4 μ L，ddH20 24 μ Lo
[0039] PCR 反應(yīng)條件：98°C 10s，65°C 15s，72°C 50s，循環(huán) 30 次；72°C 7min。
[0040] 用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并使用Takara膠回收試劑盒純化目 的片段，再將純化的片段克隆到載體口1019-1'上。克隆體系：1以1^?1?19-1'載體、4以1^純 化后的片段，輕輕混勻；25°C反應(yīng)20min后，加入50yL DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min， 42°〇熱激3〇8，立即置于冰上2!1^11。迅速加入25(^1^1^培養(yǎng)基，200印111、37°0條件下培養(yǎng) lh。取200 μ L菌液涂含氨芐青霉素的LB平板，過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取10個(gè)陽(yáng)性菌落接含氨芐 青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為 pMD19_18Sdown。
[0041] 3.構(gòu)建質(zhì)粒 pBS_Ze〇-18Sup
[0042] 借助SacI和BamHI酶切位點(diǎn)將18SrDNA上游同源臂插入質(zhì)粒pBS-Zeo中 Zeocin (博萊霉素）抗性基因片段的上游，構(gòu)建質(zhì)粒pBS-Ze〇-18Sup。
[0043] pMD19-18Sup、pBS-Zeo 分別進(jìn)行雙酶切。酶切體系：CldH