清白蛋白）5 μ L，載體 26 μ L。酶切溫度：37°C〇
[0075] 用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，并使用Takara膠回收試劑盒純化目的 片段，再將純化的片段用T4連接酶連接過夜。T4連接酶體系：CldH2O 11. 5 μ L，T4Ligase 1 μ L，T4Ligase buffer 2· 5 μ L，片段 8 μ L，載體 2 μ L0
[0076] 取連接過夜后的反應(yīng)液5yL加入50yL DH5a感受態(tài)細胞中，冰浴30min，42°C 熱激3〇8，立即置于冰上2!1^11。迅速加入25(^1^1^培養(yǎng)基，200印111、37°0培養(yǎng)111。取 200 μ L菌液涂含氨芐青霉素的LB平板，過夜培養(yǎng)后，挑取10個陽性菌落接含氨芐青霉素 的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒并測序。將序列驗證正確的陽性重組質(zhì)粒命名為 pMD19-PMT〇
[0077] 4、構(gòu)建載體 pBZ18S-PMT
[0078] 借助ClaI和EcoRV酶切位點將蘋果酸酶基因的表達盒插入pBZ-18S中18SrDNA 下游同源臂與Zeocin抗性基因片段之間，構(gòu)建載體pBZ18S-PMT。
[0079] pMD19-PMT、pBZ-18S 分別進行雙酶切。酶切體系：CldH2O 60 yL，ClaI 2 yL，EcoRV 2 μ L，10 XH buffer 10 μ L，載體 26 μ L。酶切溫度：37°C。
[0080] 用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，并使用Takara膠回收試劑盒純化目的 片段，再將純化的片段用T4連接酶連接過夜。T4連接酶體系：CldH2O 11. 5 μ L，T4Ligase 1 μ L，T4Ligase buffer 2· 5 μ L，片段 8 μ L，載體 2 μ L0
[0081] 取連接過夜后的反應(yīng)液5以1^加入50以1^0冊€1感受態(tài)細胞中，冰浴3〇1^11，42°〇熱 激3〇8，立即置于冰上211^11。迅速加入25(^1^1^培養(yǎng)基，200卬111、37°0培養(yǎng)111。取20(^1^ 菌液涂含氨芐青霉素的LB平板，過夜培養(yǎng)后，挑取10個陽性菌落接含氨芐青霉素的LB液 體培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒并進行測序。將序列驗證正確的陽性重組質(zhì)粒命名為 pBZ18S-PMT〇
[0082] 實施例3同源重組及產(chǎn)DHA的裂殖壺菌基因工程菌的篩選
[0083] 1)取IOmL裂殖壺菌（Schizochytrium sp. )HX_308菌液放入無菌預(yù)冷的50mL聚 丙稀管內(nèi)，在4°C、5000r/min離心10min，棄上清，用IOmL預(yù)冷的無菌水清洗菌體兩次，在 4°〇、4472\8離心101^11。用101^預(yù)冷的1111〇1/1山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，4°〇、50001·/ min離心10min，重復(fù)1次。用IOmL預(yù)冷的lmol/L山梨醇溶液將菌體沉淀重懸。
[0084] 2)將質(zhì)粒pBZ18S-PMT加入到30 yL步驟1)預(yù)處理后的裂殖壺菌 (Schizochytrium sp. )HX-308中，輕輕混勾，冰浴靜置5min，然后轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的電擊杯 中，靜置1〇11^11。設(shè)置電擊參數(shù)0.751^，200〇,50以？。電擊后加入11^種子培養(yǎng)基（同實 施例4中），30°C、200r/min復(fù)蘇lh，隨后將轉(zhuǎn)化的菌液涂布在含有1. 5 μ g/mL Zeocin的平 板上（種子培養(yǎng)基添加2 %瓊脂），28 °C避光培養(yǎng)。
[0085] 3)在抗性平板上篩選單菌落，搖瓶培養(yǎng)后，提取基因組DNA后，以基因組DNA為 模板PCR擴增目的片段，測序驗證正確的重組菌命名為裂殖壺菌（Schizochytrium sp.) HX-MEo
[0086] 實施例4采用基因工程菌裂殖壺菌（Schizochytrium sp. )HX-ME生產(chǎn)DHA
[0087] 分別采用原始菌裂殖壺菌（Schizochytrium sp. )HX_308和基因工程菌裂殖壺菌 (Schizochytrium sp.) ΗΧ-ΜΕ 發(fā)酵生產(chǎn) DHA。
[0088] 1.發(fā)酵培養(yǎng)方法
[0089] 以10% (v/v)的接種量將三級種子液接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基中。培養(yǎng)時，5L發(fā)酵罐裝 液量為3L，發(fā)酵過程中需要補充葡萄糖以使發(fā)酵液中葡萄濃度高于15g/L ;通氣量為lvvm， 攪拌轉(zhuǎn)速為350rpm，初始糖濃度為40g/l，發(fā)酵溫度為30°C。發(fā)酵時間為7天。
[0090] 其中，種子培養(yǎng)基（g/L)組成為：葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸鈉10g/L、 KH2P044g/L、NaCl 15g/L、MgCl23g/L、CaCl2 · 2H20 lg/L、KCl 2g/L、MgSO4 · 7H20 5g/L、 FeCl3O. lg/L，滅菌條件：121°C、30min。
[0091] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L)組成為：葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸鈉10g/L、KH2P0 44g/ L、NaCl 15g/L、MgCl23g/L、（NH4) 2S046g/L、KCl 2g/L、MgSO4 · 7H205g/L、FeCl3O. lg/L，滅菌 條件：121°C、30min。
[0092] 2.檢測方法
[0093] 在發(fā)酵過程中，每天取樣進行如下檢測：
[0094] (1)油脂含量的測定方法：取一定體積的發(fā)酵液（100mL)，將其在50°C預(yù)熱，用 NaOH溶液將pH調(diào)至10-12之間，按3%。（g/Ι)的比例添加破壁酶，50°C下攪拌并保溫2h ;按 1:1:1(發(fā)酵液：乙醇：正己烷）（v/v)比例分別添加乙醇、正己烷，攪拌、分層、萃取，連續(xù)萃 取2-3次，取正己烷相，真空旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，獲取油脂。將燒瓶放在烘箱中105°C烘至恒重， 冷卻后稱重。
[0095] (2)油脂中DHA含量檢測方法：采用常規(guī)方法將本實施例標題2中⑴提取的油 脂進行甲酯化，然后利用日本島津高效氣相色譜儀檢測油脂中DHA含量。氣相分析條件：色 譜柱：DB-23(60m*0. 25mm*0. 25 μπι);檢測器：FID ;載氣：氮氣；分流比：30/1 ;進樣口溫度： 250°C ;檢測器溫度：280°C ;進樣量：1 μ 1 ;升溫程序：初始柱溫為100°C，先以25°C /min的 速度升至196°C，再以2°C /min的速度升至220°C，保持12min。柱流速：3. Oml/min ;尾吹流 速：30ml/min ;氫氣流速：40ml/min ;空氣流速：400ml/min。
[0096] (3)細胞干重（DCW)測定：取30mL發(fā)酵液，離心收集，棄去上清。菌體于105°C烘 至恒重，測定即為細胞干重。
[0097] (4)葡萄糖濃度測定：取發(fā)酵液ImL于1.5mL離心管中，室溫下，12000rpm離心 2min，取100 μ L上清至IOmL容量瓶，用娃哈哈水定容至10mL，然后利用生物傳感器測定發(fā) 酵液中的葡萄糖濃度，測得數(shù)值的單位為g/L。
[0098] 3.結(jié)果
[0099] 在發(fā)酵結(jié)束時，原始菌和基因工程菌的產(chǎn)油量達到峰值。原始菌的最高產(chǎn)油量為 59. 8g/L發(fā)酵液，其中DHA產(chǎn)量只有27. 3g/L發(fā)酵液?；蚬こ叹淖罡弋a(chǎn)油量達到72. 5g/ L，其中DHA產(chǎn)量高達32. 6g/L發(fā)酵液?？梢钥吹?，重組裂殖壺菌工程菌菌與原始菌相比，產(chǎn) 油量增加了 12%，其中DHA產(chǎn)量增加了 19. 5%。
【主權(quán)項】
1. 一種產(chǎn)DHA的裂殖壺菌基因工程菌，是在裂殖壺菌基因組中整合有蘋果酸酶基因的 表達盒的工程菌，所述蘋果酸酶基因的表達盒依次含有啟動子、蘋果酸酶基因和終止子。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述裂殖壺菌基因工程菌，其特征在于所述啟動子為泛素啟動子， 所述蘋果酸酶基因如SEQ ID NO: 1所示，所述終止子為泛素終止子。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述裂殖壺菌基因工程菌，其特征在于所述整合位點為ISsrDNA。4. 權(quán)利要求1-3之一所述裂殖壺菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建含有蘋果 酸酶基因的表達盒的同源重組片段；將所述同源重組片段導(dǎo)入裂殖壺菌進行同源重組，篩 選獲得所述裂殖壺菌基因工程菌。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述裂殖壺菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述同源重組片 段中在所述蘋果酸酶基因的表達盒的兩端設(shè)有ISsrDNA的上、下游同源臂，所述ISsrDNA的 上游同源臂序列如SEQ ID NO:2所示，18srDNA的下游同源臂如SEQ ID NO:3所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述裂殖壺菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述同源重組片 段攜帶有博萊霉素抗性標記基因。7. 采用權(quán)利要求1-3之一所述裂殖壺菌基因工程菌制備DHA的方法，其特征在于采 用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)裂殖壺菌基因工程菌，然后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基制備DHA ;所述種子培養(yǎng) 基含有：葡萄糖 40g/L、酵母膏 2g/L、谷氨酸鈉 10g/L、KH2P044g/L、NaCl 15g/L、MgCl23g/L、 CaCl2 ? 2H20 lg/L、KCl 2g/L、MgSO4 ? 7H20 5g/L、FeCl3O. lg/L ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有：葡萄 糖 40g/L、酵母膏 2g/L、谷氨酸鈉 10g/L、KH2P044g/L、NaCl 15g/L、MgCl23g/L、（NH4)2S046g/ L、KCl 2g/L、MgSO4 ? 7H20 5g/L、FeCl3O. lg/L。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種產(chǎn)DHA的裂殖壺菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。所述產(chǎn)DHA的裂殖壺菌基因工程菌，是在裂殖壺菌基因組中整合有蘋果酸酶基因的表達盒的工程菌，所述蘋果酸酶基因的表達盒依次含有啟動子、蘋果酸酶基因和終止子。所述裂殖壺菌基因工程菌的構(gòu)建方法，包括：構(gòu)建含有蘋果酸酶基因的表達盒的同源重組片段；將所述同源重組片段導(dǎo)入裂殖壺菌進行同源重組，篩選獲得所述裂殖壺菌基因工程菌。本發(fā)明還提供采用所述裂殖壺菌基因工程菌制備DHA的方法，采用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)裂殖壺菌基因工程菌，然后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基制備DHA。本發(fā)明裂殖壺菌基因工程菌能夠高產(chǎn)DHA，構(gòu)建方法簡單、效率高、成本較低。
【IPC分類】C12N15/80, C12P7/64, C12N1/15
【公開號】CN104974944
【申請?zhí)枴緾N201510417269
【發(fā)明人】黃和, 莫凱強, 紀曉俊, 任路靜, 莊小燕, 李干祿
【申請人】南京工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年7月15日