水霉菌伊文思藍活體染色方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控技術(shù)領域，具體涉及水生動物寄生水霉的伊文思藍活體染色法方法。本發(fā)明簡單、易行，適合科研院所、學校、技術(shù)推廣站及水產(chǎn)養(yǎng)殖公司應用。
技術(shù)背景
[0002]水霉病是水生動物(如:魚、蝦、蟹、龜、蛙等)體表的一種水霉寄生病，水霉對寄主無嚴格選擇性，各種水生動物，從卵到各齡成體都可感染。當水生動物體表皮膚因物理化學因素，或細菌、病毒感染受損傷時，水霉的游動孢子侵入傷口，吸取皮膚及其組織內(nèi)的營養(yǎng)而迅速生長，菌絲與傷口的組織細胞纏繞粘附，使組織發(fā)炎、壞死，水生動物因負擔過重，游動失常，食欲減退，很快瘦弱死亡。水霉在寄主死后不久繁殖特別快，所以具腐生性，對水產(chǎn)動物是一種繼發(fā)性感染。長期以來，水霉病的防治是水生動物病害防治中最棘手的一個難題之一，水霉病的頻發(fā)給全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。為了更好地開展對水霉病的防治工作，國內(nèi)外許多科學家都致力于水霉屬(Saprolegnia)的研宄。
[0003]在防治水霉藥物的篩選過程中，需要知道藥物在藥物片理后的效果，常需進行活體培養(yǎng)，如:CN 103536586 A，水霉菌絲殺滅實驗中，用無菌鑷子取出浸泡過的水霉小塊置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)觀察5d。孵育期每24h觀察一次，肉眼判定無水霉菌落生長的，表示此種藥物在該濃度該作用時間下對水霉菌絲具有殺滅作用。每個濃度設兩個對照，同時設經(jīng)蒸餾水浸泡過的水霉塊空白對照。由于培養(yǎng)試驗時間長，費工費時，故經(jīng)常會殆誤最佳防治時機，給水產(chǎn)動物養(yǎng)殖者帶來經(jīng)濟損，所以從科研、應用的實際出發(fā)，急需設計一種快速判斷水霉菌活力的方法。
[0004]本發(fā)明本著廉價、易得、操作簡易、直觀快速的原則設計出一種水霉伊文思藍活體染色法。該發(fā)明因簡單、易行、快速等特點，非常適合科研院所、技術(shù)推廣部門和基層水產(chǎn)養(yǎng)殖單位應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種水霉伊文思藍活體染色法。
[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0007]水霉伊文思藍活體染色方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008](I)從水生動物體表取少量含水霉菌絲的組織或帶有水霉菌的卵在75%的酒精中浸泡2-3min，用無菌水沖洗數(shù)次后置于PDA鏈霉素半固體平板中央，平板倒置，在20-25 °C條件下培養(yǎng)；
[0009](2)切取步驟(I)平板中菌落邊緣的菌絲塊，在75%的酒精中浸泡2-5seC，用無菌水沖洗后將菌絲面朝下反接種到新的PDA半固體平板的中央，均勻在平板空白處放入水霉菌誘餌；半固體將平板倒置放入20-25?恒溫培養(yǎng)恒溫繼續(xù)培養(yǎng)，待誘餌上覆蓋菌絲后將其取出并置于無菌水的6孔板中，于20-25?培養(yǎng)直至游動孢子釋放；吸取100 μ L孢子懸液至PDA半固體平板上均勻涂布，20-25°C恒溫培養(yǎng)并切取單菌落瓊脂塊到PDA半固體平板上進行純化培養(yǎng)；提純后的水霉菌株可置于4°C保存；
[0010](3)用2-5%。的伊文思藍染液，浸染水霉菌絲、孢子Ι-lOmin，然后顯微鏡檢觀察，著藍色者為死細胞；不著色者為活細胞；
[0011](4)根據(jù)未著色細胞占整體細胞的比例，可計算出活細胞的百分率；死細胞百分率(％ ) = 100 —活細胞百分率。
[0012]進一步地，步驟⑴中所述PDA鏈霉素平板的制備方法為:①配制PDA半固體培養(yǎng)基，配方如下:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂條6g或瓊脂粉4g，自來水1000ml ;②將PDA半固體培養(yǎng)基溶化后，冷卻至45-60°C，注入200mg/l的鏈霉素，制成平板。
[0013]伊文思藍染液配制方法:伊文思藍2-5g，用無菌水定容至1000ml。
[0014]本發(fā)明的具體方法為:
[0015]1、PDA半固體培養(yǎng)基的制作:
[0016]A、配方:
[0017]馬鈴薯200g，葡萄糖20g，自來水1000ml，瓊脂條6g (或瓊脂粉4g)自然pH。
[0018]B、制法:
[0019]馬鈴薯去皮后，切成小塊，加水煮爛(煮沸20-30min，能被玻璃棒戳破即可)，用4層紗布過濾，再加入糖與瓊脂，加熱融化后補足水到1000ml，分裝于三角瓶中，用紗布+牛皮紙(報紙)+棉線扎封口。然后在于121°C條件下滅菌20min。
[0020]*注意事項:
[0021]⑴、三角瓶中的裝液量以不超過總?cè)萘康?/2?3/5為宜，以防止滅菌時培養(yǎng)基在沸騰中沾污紗布及存放中易導致瓶內(nèi)培養(yǎng)基染菌等。
[0022]⑵、用高壓滅菌鍋時要注意排冷空氣，防止“假升鎊”現(xiàn)象。
[0023]⑶、培養(yǎng)皿在清洗后，用紙包好可在高壓滅菌鍋中于121°C條件下滅菌15-20min，待自然降壓為“O”后，取出置于干燥箱中烘干，等降溫后置于超凈工作臺中備用。(也采取干法滅菌:將培養(yǎng)皿在清洗后，用紙包好置于160°C的烘箱中滅菌2h后備用)
[0024]C、倒平板:
[0025]滅過菌后的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿放在超凈工作臺中，先用紫外線滅菌15min后關掉紫外燈，后打開風機使超凈工作臺中呈正壓狀態(tài)；操作員的雙手洗凈后，用酒精棉球擦拭后伸入操作臺中，等培養(yǎng)基降溫到45-60°C后在酒精燈旁將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿中倒入15ml左右(注意:據(jù)有關資料報道瓊脂在43°C以下會凝固，故倒平板時培養(yǎng)基的溫度高一些，可提高培養(yǎng)基的流動性)，倒平板后放置到第二天使用(等培養(yǎng)基中的冷凝水干后使用一為加快速度可用“疊皿法”倒平板且倒后平板后加大超凈工作臺中的風量)。
[0026]*相關的微生物操作方法:可參考周德慶《微生物學實驗教程》第2版
[0027]2、水霉株的分離、提純培養(yǎng):
[0028]分離:
[0029]從水生動物體表取少量含水霉菌絲的組織或?qū)в兴咕穆严仍?5%的酒精中浸泡2-3min，用無菌水沖洗數(shù)次后置于PDA鏈霉素平板(將PDA半固體培養(yǎng)基溶化后，冷卻至45-60°C，注入200mg/L的鏈霉素，制成平板)，中央，平板倒置在20-25°C條件下培養(yǎng)。
[0030]提純:
[0031]在酒精燈下用灼燒冷卻后的解剖刀切取分離平板中菌落邊緣的菌絲塊(2*2-5*5mm2)在75%的酒精中浸泡2-5seC，迅速用無菌水沖選后反