接種(將菌絲面朝下)到新的PDA半固體平板的中央，再均勻在培養(yǎng)皿中空白處放入5-20粒無菌油菜籽(水霉菌誘餌)；扣上皿蓋后將平板倒置(皿底在上，皿蓋在下防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā))放入20-25?恒溫培養(yǎng)恒溫繼續(xù)培養(yǎng)，待油菜籽上覆蓋菌絲后將其取出并置于無菌水的6孔板中，于20-25°C培養(yǎng)直至游動孢子釋放。無菌吸取100 μ I孢子懸液至PDA半固體平板上均勻涂布，20-25?恒溫培養(yǎng)并切取單菌落瓊脂塊到PDA半固體平板上進行純化培養(yǎng)。提純后的水霉菌株可置于4°C保存。
[0032]3、水霉(菌絲、孢子)伊文思藍活體快速染色觀察
[0033]快速判斷水霉菌(孢子與菌絲)活性，是科研工作者十分關心的問題。常規(guī)的方法是通過活體培養(yǎng)的方法來鑒定，這種方法可靠，但是耗時長(少則幾h，多則l-5d)，經(jīng)常會殆誤最佳防治時機，給水產(chǎn)動物養(yǎng)殖者帶來經(jīng)濟損失。在動、植物實驗中經(jīng)常用中性紅，臺盼藍對細胞染色來快速判斷細胞的活力情況(如王珂，梁文艷，王金麗.銅綠微囊藻中性紅染色研宄.環(huán)境科學與技術)；而在水霉活體快速染色觀察則鮮見報道；為此本發(fā)明做了大量的活體染色劑的篩選實驗，最后確定了 “水霉菌伊文思藍活體染色法”:取少量的水霉菌(孢子與菌絲)，用2-5%。伊文思藍染色液浸染Ι-lOmin，然后用顯微鏡觀察，水霉菌(孢子與菌絲)有活性時不著色，無活性時著藍色。
[0034]伊文思藍，中文名:偶氮藍，6，6’-[[3，3’-二甲基(1，I’-二苯基)_4，4’-二基]雙(偶氮基)]雙(4-氨基-5-羥基-1，3-萘二磺酸)四鈉鹽，分子式C34H24N6NA4014S，水溶性 280g/l(20°C ) ο
[0035]伊文思藍常用于檢測細胞膜完整性和細胞是否存活?；罴毎蛴型馀殴δ芏鵁o法被伊文思藍染色，而死細胞則會被染成淡藍色，因此可以通過此方法在顯微鏡下區(qū)分死細胞與活細胞，但無法區(qū)分死亡與壞死。
[0036]本發(fā)明的有益效果:
[0037]1、首次提出了水霉孢子與菌絲的伊文思藍活體染色法:有活力的水霉孢子與菌絲均不著色，無活力的水霉孢子與菌絲著藍色；故顯微鏡檢時只要看孢子與菌絲是否著藍色便能知道孢子與菌絲的活力情況。
[0038]2、根據(jù)未著色細胞占整體細胞的比例，可計算出活細胞的百分率；死細胞百分率(% ) = 100 一活細胞百分率。
[0039]3、伊文思藍法判定水霉(菌絲與孢子)活力情況，所需時間短；僅需Ι-lOmin.
[0040]總之，本發(fā)明具有簡單、易行、快速、直觀等特點；適用于科研院所、學校、技術推廣站及水產(chǎn)養(yǎng)殖公司。
【具體實施方式】
[0041 ] 下面通過具體實施例來進一步說明。
[0042]實施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍；此外應理解為:在閱讀本發(fā)明所敘述之后，本領域的技術人員可能對本發(fā)明作各種改動與修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限制的范圍。
[0043]實施例1:
[0044]HGSMOl水霉株:2013年4月分離自安徽滁州市水產(chǎn)良種場黃金鯽卵生水霉，2013年10月將生物樣品寄達上海海洋大學(國家水生動植物病原庫)進行菌株分子生物學鑒定后確認為多子水霉。
[0045]取生長在在水霉半固體平板中的油菜籽誘餌(長滿有水霉菌絲)與剛剛釋放出的水霉孢子(具體參考水霉菌提純操作)，分為2組，每組6個平行。一組用80°C水浴1min (試驗組)，另一組不作處理(參照組)，每組取3個平行然后加入2%。伊文思藍水溶液浸染2min后顯微鏡檢，試驗組水霉(菌絲與孢子)全部被染成淡藍色，參照組均為無色；將試驗組與參照組的水霉材料(另3個平行)分別接種到PDA半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24、48h后觀察，培養(yǎng)結果顯示:試驗組均沒有菌絲生長；參照組均有菌絲生長。
【主權項】
1.水霉伊文思藍活體染色方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)從水生動物體表取少量含水霉菌絲的組織或帶有水霉菌的卵在75%的酒精中浸泡2-3min,用無菌水沖洗數(shù)次后置于PDA鏈霉素半固體平板中央，平板倒置，在20_25°C條件下培養(yǎng)； (2)切取步驟(I)平板中菌落邊緣的菌絲塊，在75%的酒精中浸泡2-5seC，用無菌水沖選后將菌絲面朝下反接種到新的PDA半固體平板的中央，均勻在平板空白處放入水霉菌誘餌；半固體將平板倒置放入20-25?恒溫培養(yǎng)恒溫繼續(xù)培養(yǎng)，待誘餌上覆蓋菌絲后將其取出并置于無菌水的6孔板中，于20-25°C培養(yǎng)直至游動孢子釋放；吸取100 μ L孢子懸液至PDA半固體平板上均勻涂布，20-25?恒溫培養(yǎng)并切取單菌落瓊脂塊到PDA半固體平板上進行純化培養(yǎng)；提純后的水霉菌株可置于4°C保存； (3)用2-5%。的伊文思藍染液，浸染水霉菌絲、孢子Ι-lOmin，然后顯微鏡檢觀察，著藍色者為死細胞；不著色者為活細胞； (4)根據(jù)未著色細胞占整體細胞的比例，可計算出活細胞的百分率；死細胞百分率(% ) = 100 一活細胞百分率。2.根據(jù)權利要求1所述水霉伊文思藍活體染色方法，其特征在于，步驟(I)中所述PDA鏈霉素平板的制備方法為:①配制PDA半固體培養(yǎng)基，配方如下:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂條6g或瓊脂粉4g，自來水100ml ;②將PDA半固體培養(yǎng)基溶化后，冷卻至45_60°C，注Λ 200mg/l的鏈霉素，制成平板。3.根據(jù)權利要求1所述水霉伊文思藍活體染色方法，其特征在于，伊文思藍染液配制方法:伊文思藍2-5g，用無菌水定容至1000ml。
【專利摘要】本發(fā)明公開水霉伊文思藍活體染色方法，包括水霉株的分離、提純培養(yǎng)、水霉孢子的獲取，伊文思藍染液的配制，染色方法等步驟，只要顯微鏡檢染色后的水霉菌絲與孢子是否著藍色，就可快速判定水霉菌絲的活力情況，通過細胞是否著色數(shù)量占整體細胞的百分比，就可簡易計算出活細胞與死細胞的百分率。本發(fā)明具有簡單、易行、快速、直觀等特點；適用于科研院所、學校、技術推廣站及水產(chǎn)養(yǎng)殖公司。
【IPC分類】C12Q1/06, C12R1/645
【公開號】CN104988204
【申請?zhí)枴緾N201510402065
【發(fā)明人】周呈祥, 葉偉武, 同現(xiàn)鵬, 張繁榮, 仲崇艷, 凌武海, 夏文偉
【申請人】杭州銀江環(huán)?？萍加邢薰?br>【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年7月7日