煙草花序中提取西柏烷二萜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從煙草花序中提取生物活性物質(zhì)的方法，特別是一種從煙草花序 中提取西柏烷二萜的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國(guó)是世界第一煙葉生產(chǎn)大國(guó)，煙葉總產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的41. 5%。目前我 國(guó)煙草主要種植在云南、貴州、四川等貧困山區(qū)，煙草種植已經(jīng)成為貧困地區(qū)農(nóng)民擺脫貧困 的重要途徑。近年來(lái)，在國(guó)內(nèi)外控?zé)熯\(yùn)動(dòng)的推動(dòng)下，煙草作為卷煙原料的使用量大幅減少， 這給許多煙草種植區(qū)域的農(nóng)村經(jīng)濟(jì)帶來(lái)挑戰(zhàn)。為緩解煙草種植對(duì)卷煙原料需求的依賴，國(guó) 內(nèi)外科學(xué)家開始關(guān)注煙草替代用途研究，煙草的新用途研究已涉入到工業(yè)、醫(yī)藥、食品等行 業(yè)。一些研究者將煙草種子油用于柴油、烷基樹脂改性劑、或應(yīng)用到肥皂和油漆生產(chǎn)，還有 研究者致力于煙草中提取的蛋白質(zhì)、茄尼醇、綠原酸、煙堿等在食品、藥品和植物源農(nóng)藥中 的應(yīng)用研究。
[0003] 日本學(xué)者研究（1984)發(fā)現(xiàn)，煙草中的西柏烷二萜可作為腫瘤抑制劑； Ferchmin，P.A. (1999)研究證明煙草和珊瑚中的西柏烷醇具有抑制小鼠尼古丁感受的活 性，西柏烷及其衍生物可能在禁煙及治療尼古丁上癮方面具有重要用途；Aqil，F(xiàn)等（2011) 研究發(fā)現(xiàn)，煙草2, 7, 11-西柏三烯-4, 6-二醇具有廣泛的抗菌、抗氧化以及抗腫瘤活性； 2012年5月，佩德羅*A?費(fèi)爾什米恩等公開了一項(xiàng)"保護(hù)和治療神經(jīng)損傷的方法和組合物" 專利，該專利以煙草4R西柏烷內(nèi)酯或4S西柏烷內(nèi)酯作為神經(jīng)保護(hù)劑保護(hù)和治療由有機(jī)磷 酸酯、NMDA和局部缺血的多種神經(jīng)損傷。B.S.Kennedy等研究發(fā)現(xiàn)煙草西柏三烯二醇能有 效抑制黃瓜炭疽病的發(fā)展。Menetrez等研究發(fā)現(xiàn)，西柏烷三稀二醇具有抗煙草霜霉病菌的 活性。而在煙草品質(zhì)化學(xué)研究中，煙草西柏烷二萜被認(rèn)為是一種重要的香氣前體物。
[0004] 西松烷二萜屬于十四元大環(huán)二萜，主要存在于煙草和海洋生物（主要為軟珊瑚、 柳珊瑚）中，以煙草中含量較為豐富。西柏烷二萜是煙草表面腺毛分泌物的主要成分，其 中，a-4, 8, 13-西柏三烯-1，3-二醇和P-4, 8, 13-西柏三烯-1，3-二醇是煙草主要的西 柏烷二萜。研究證明，煙草腺毛具有較高的分泌能力。G.J. Wagner (1991)等研究發(fā)現(xiàn)煙草 TI1068品種的分泌物量約占煙葉干重的10%。Severson等研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，美國(guó)烤煙、白肋 煙、馬里蘭煙、雪茄煙外包皮、深色明火烤煙、雪茄煙內(nèi)包皮和香料煙中西柏烷二萜分別占 總分泌物質(zhì)量的 95%、96%、96%、95%、96%、78%、70%。
[0005] 為充分利用煙草西柏烷二萜資源，國(guó)內(nèi)外研究者開展了煙草西松烷二萜提取、分 離技術(shù)研究。公開號(hào)為CN102206138A的中國(guó)發(fā)明專利介紹了一種從新鮮煙葉中提取、分 離和純化煙草主要西柏烷二萜--a-4, 8, 13-西柏三烯-1，3-二醇和P-4, 8, 13-西柏 三烯-1，3-二醇的方法，該方法將從鮮煙葉浸提獲得的表面分泌物粗膏依次通過(guò)復(fù)雜的萃 取、反萃取、五個(gè)梯度的正相硅膠柱分離、三個(gè)梯度的正相氰基柱分離，最后再應(yīng)用制備色 譜分別獲得了a_4, 8, 13-西柏二稀-1，3-二醇和0 -4, 8, 13-西柏二稀-1，3-二醇純品。
[0006][0007] 以上技術(shù)均以煙草葉片作為提物西柏烷二萜的原料，存在浪費(fèi)煙草原料，且方法 繁瑣，需要較為昂貴的儀器一一制備色譜等問(wèn)題。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，煙草花表面分泌物中西 柏烷二萜含量是葉片的5-10倍，甚至更高，而在煙葉生產(chǎn)過(guò)程中，煙草花序在煙草開花期 打頂后全部被廢棄，造成極大浪費(fèi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為克服目前西柏烷二萜提取過(guò)程中存在浪費(fèi)煙草葉片資源、提取步驟繁瑣、需 用昂貴儀器等問(wèn)題，本發(fā)明以生產(chǎn)中廢棄的煙草花序?yàn)槲靼赝槎频奶崛〔牧?，?yīng)用溶 劑沉淀技術(shù)同時(shí)加入活性炭分別除去提取物中的高級(jí)烷烴和色素，獲得西柏烷二萜粗提 物，并將西柏烷二萜粗提物用于抑制蘋果腐爛病菌。西柏烷二萜提取物再通過(guò)硅膠柱層 析，分離獲得大量高純度的煙草主要西柏烷二萜--a-4, 8, 13-西柏三烯-1，3-二醇和 0 -4, 8, 13-西柏二稀 _1，3_ 二醇。
[0009] 本發(fā)明煙草花序中提取西柏烷二萜的方法，包括如下步驟：
[0010] (1)浸提：選取煙草花序原料，用二氯甲烷進(jìn)行浸提，得到浸提液；
[0011] (2)濃縮：去除浸提液水分，減壓濃縮，回收溶劑，獲得粗提物浸膏；
[0012] (3)沉淀烷烴并除去色素：將浸膏溶于70%的乙醇溶液，液固的體積質(zhì)量比為 6-8:1，同時(shí)每克浸膏加入0.Ig活性炭，溶解后離心，過(guò)濾取上清液，沉淀用70%乙醇重復(fù) 洗滌三次，過(guò)濾取上清液，合并所有上清液，減壓濃縮至原體積的50 %，按濃縮后上清液與 水體積比3:1的比例加入水形成待萃取液，加入與待萃取液同等體積的石油醚萃取四次， 合并石油醚層并減壓濃縮，回收溶劑，獲淺黃色西柏烷二萜粗提取物；
[0013] (4)硅膠柱層析：取上述粗提取物，干法上樣，進(jìn)行第一硅膠柱層析，先用體積比 5:1的石油醚/乙酸乙酯洗脫，至無(wú)餾分流出，再用體積比3:1的石油醚/乙酸乙酯洗脫，收 集第二餾分并合并，濃縮后再進(jìn)行第二硅膠柱層析，干法上樣，以體積比5:1的氯仿/丙酮 作為洗脫劑分尚洗脫，先后分別獲得P_4, 8, 13-西柏二稀-1，3_二醇和a-4, 8, 13-西柏 二稀-1，3_ 二醇。
[0014] 所述步驟（1)中：
[0015] 煙草花序的來(lái)源包括烤煙、晾曬煙、雪茄煙、白肋煙、香料煙或馬里蘭煙中的一種 或多種，本提取方法適用于各種煙葉品種。
[0016] 煙葉花序可以選用生產(chǎn)中廢棄的新鮮的或干燥的煙葉花序。
[0017] 浸提的具體方法為：將煙草花序依次在3個(gè)盛有二氯甲烷的容器中浸提，每個(gè)容 器中連續(xù)浸提兩次，每次ls_2s，浸提過(guò)程中，二氯甲烷顏色變黃褐時(shí)更換溶劑。
[0018] 所述步驟⑵中：
[0019] 去除水分的方式為向浸提液中加入無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行干燥處理，無(wú)水硫酸鈉吸收浸 提液中的水，成為水合硫酸鈉，干燥完全后過(guò)濾除去水合硫酸鈉，減壓濃縮的溫度為40°C。
[0020] 所述步驟⑶中：
[0021] 溶解的方法為攪拌或超聲；70%乙醇洗滌沉淀時(shí)，70%乙醇與沉淀的體積質(zhì)量比 為6-8:1 ;上清液的減壓濃縮溫度為50-60°C;石油醚層的減壓濃縮溫度為50-55°C。其中 乙醇用于沉淀烷烴，活性炭用于除去色素。
[0022] 所述步驟⑷中：
[0023] 硅膠為 200-300 目；
[0024] 體積比5:1的石油醚/乙酸乙酯用以洗脫粗提取物中極性較低的非目標(biāo)組分；
[0025] 體積比3:1的石油醚/乙酸乙酯用以洗脫西柏烷二萜，即所述的第二餾分；
[0026] 體積比5:1的氯仿/丙酮用以先后分別洗脫0 _4, 8, 13-西柏二稀_1，3_二醇、 a-4, 8, 13-西柏三烯-1，3-二醇，兩種組分得以完全分離。
[0027] 本發(fā)明的有益效果是：
[0028] (1)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)煙草西柏烷二萜的提取及研究?jī)H僅是局限在煙草葉片，而未見 煙草花序的報(bào)道，這是因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員一般認(rèn)為葉片中有效成分的含量更高，因此利 用率也就更高；相反地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，作為廢棄物的煙草花序中西柏烷二萜含量是葉片的 5-10倍或更高，因此本發(fā)明選擇煙草花序作為原材料是克服了技術(shù)偏見，取得了預(yù)料不到 的技術(shù)效果。
[0029] (2)應(yīng)用煙草花序作為提取具有多種生物活性的西柏烷二萜化合物材料，不僅充 分利用了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄資源，節(jié)約了成本，提高了煙草的綜合利用價(jià)值。而且由于煙草花表 面分泌物西柏烷二萜含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉片，可以大大節(jié)約溶劑用量及層析材料消耗，減少能 耗，保護(hù)環(huán)境。
[0030] (3)本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)單的溶劑沉淀技術(shù)除去花表面提取物中的高級(jí)烷烴，獲得的煙 草西柏烷二萜提取物中有效成分的含量達(dá)到92%以上，可以用于抑制蘋果腐爛病菌生長(zhǎng)， 減少蘋果病害防治過(guò)程中化學(xué)農(nóng)藥使用。
[0031] (4)本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)單的溶劑沉淀和活性炭吸附技術(shù)分別除去花表面提取物中的高 級(jí)烷烴、色素，再通過(guò)硅膠柱層析將煙草兩種主要的西柏烷二萜進(jìn)行純化、分離，克服了以 往技術(shù)繁瑣且需要昂貴儀器（如制備色譜等）的缺點(diǎn)，步驟簡(jiǎn)單，適用于批量化生產(chǎn)。
[0032] (5)本發(fā)明通過(guò)溶劑沉淀除去烷烴和色素，獲得的西柏烷二萜相對(duì)花表面分泌物 浸膏的回收率達(dá)62%以上，西柏烷二萜回收率達(dá)95%以上，純度達(dá)92%以上。西柏烷二萜 進(jìn)一步層析分尚獲得a-4,