8, 13-西柏二稀-1，3-二醇和0 -4, 8, 13-西柏二稀-1，3-二醇， 相對于花表面分泌物浸膏的回收率分別為23. 3%和6. 79%，純度分別達95%以上。
【附圖說明】
[0033] 圖1 :西柏烷二萜提取物對蘋果腐爛病菌的抑菌效果圖；
[0034] 圖2 :95%乙醇對蘋果腐爛病菌的抑菌效果圖（圖1的陰性對照）；
[0035] 圖3 :a-4, 8, 13-西柏三烯-1，3-二醇液相色譜圖；
[0036] 圖4 : -4, 8, 13-西柏三烯-1，3-二醇液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0037] 下面結合附圖及具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。
[0038] 實施例1
[0039] 1 ?取樣
[0040] 煙草大田開花期，選取667m2(-畝）種植的烤煙品種，打頂后獲得煙草花序，以新 鮮烤煙煙草花序作為提取原料。
[0041] 2?浸提
[0042] 將新鮮煙草花序依次在3個盛有3L二氯甲烷的玻璃燒容器連續(xù)浸提兩次，每次 ls-2s，浸提過程中，燒杯中二氯甲烷顏色變黃褐時及時更換溶劑。
[0043] 3?濃縮
[0044] 將上述浸提液合并，無水硫酸鈉干燥后過濾，40°C減壓濃縮，獲得ISOg深棕色浸 膏，浸膏中西柏烷二萜含量達60 %，同時回收溶劑。
[0045] 4.沉淀烷烴并除去色素
[0046] 取浸膏5g，加入35mL70%的乙醇溶液，同時加入0. 5g活性炭，常溫下超聲溶解 lOmin，離心，上清液抽濾，沉淀重復用35mL70 %乙醇洗滌三次，上清液過濾，合并，濃縮至 60-80mL，加入20-25mL水，石油醚（體積比1:1)萃取四次，石油醚層合并，50-55°C減壓濃 縮，回收溶劑。濃縮完成后，獲3.Ig淺黃色西柏烷二萜粗提取物，其中西柏烷二萜的含量達 到92. 5%以上。
[0047] 將上述西柏烷二萜粗提取物用95%乙醇配制成質量體積分數(shù)0.8%的溶液，在無 菌條件下，將西柏烷二萜溶液按體積比1:1〇〇的比例加入經滅菌后冷卻至45°C左右的PDA 培養(yǎng)基中，混勻，倒板，對照組加入等量的95%乙醇，每處理重復3次。待平板凝固后接入 生長一致的蘋果腐爛病菌菌餅（巾=6.Omm)，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h觀察 1次，直至對照長至約2/3培養(yǎng)皿處，用十字交叉法測量菌落直徑，發(fā)現(xiàn)對照菌絲生長旺盛， 直徑達到63mm，加入西柏烷提取物的蘋果腐爛病菌絲幾乎沒有生長。
[0048] 5?硅膠柱層析
[0049] 取上述除去烷烴及色素的浸膏I. 5g，干法上樣，進行第一硅膠（200-300目）柱 (I. 5cmX65cm)層析，先用石油醚/乙酸乙酯（體積比5:1)洗脫，至無餾分流出，再用石油 醚/乙酸乙酯（體積比3:1)洗脫，收集第二餾分合并、濃縮，獲得0. 96g提取物，取lOOmg， 干法上樣，進行第二硅膠（200-300目）柱（1.5cmX65cm)層析，以氯仿/丙酮（體積比 5:1)作為洗脫劑進行分離洗脫，分別獲得A物質59. 6mg，B物質17. 4mg。
[0050] 6.活性物質確認：通過核磁共振檢測，確認化合物A、B分別為a-4, 8, 13-西 柏三烯-1，3-二醇、P-4, 8, 13-西柏三烯-1，3-二醇，化合物核磁共振波普數(shù)據(jù)見表1。 a-4, 8, 13-西柏三烯-1，3-二醇和P-4, 8, 13-西柏三烯-1，3-二醇純度的純度經液相 色譜檢測（液相色譜條件：色譜柱：BH!C18L7um2.l*50mm;流動相：75%甲醇，等度洗脫； 流速：0. 3mL/min;柱溫：35°C;檢測波長：200nm)，如圖3、4所示，兩者的純度均高于95%， a-4, 8, 13-西柏三烯-1，3-二醇和-4, 8, 13-西柏三烯-1，3-二醇相對于花表面分泌物 浸膏的回收率分別為23. 3%和6. 79%。
[0051 ] 表1化合物A、B的核磁共振檢測數(shù)據(jù) [0052]
[0054] 3Data were measured in CCl3D.
[0055] 實施例2
[0056] 煙草大田開花期，選取667m2(-畝）種植的烤煙品種，打頂后收集煙草花序，陰 干，以干燥后的烤煙煙草花序為原料，其余處理同實施例1。
[0057] a-4, 8, 13-西柏三烯-1，3-二醇、-4, 8, 13-西柏三烯-1，3-二醇的純度均高于 95%，相對于花表面分泌物浸膏的回收率分別為25. 3%和8. 79%。
【主權項】
1. 一種煙草花序中提取西柏烷二萜的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 浸提：選取煙草花序原料，用二氯甲烷進行浸提，得到浸提液； (2) 濃縮：去除浸提液水分，減壓濃縮，回收溶劑，獲得粗提物浸膏； (3) 沉淀烷烴并除去色素：將浸膏溶于70%的乙醇溶液，液固的體積質量比為6-8:1， 同時每克浸膏加入〇.Ig活性炭，溶解后離心，過濾取上清液，沉淀用70 %乙醇重復洗滌三 次，過濾取上清液，合并所有上清液，減壓濃縮至原體積的50 %，按濃縮后上清液與水體積 比3:1的比例加入水形成待萃取液，加入與待萃取液同等體積的石油醚萃取四次，合并石 油醚層并減壓濃縮，回收溶劑，獲淺黃色西柏烷二萜粗提取物； (4) 硅膠柱層析：取上述粗提取物，干法上樣，進行第一硅膠柱層析，先用體積比5:1 的石油醚/乙酸乙酯洗脫，至無餾分流出，再用體積比3:1的石油醚/乙酸乙酯洗脫，收集 第二餾分并合并，濃縮后再進行第二硅膠柱層析，干法上樣，以體積比5:1的氯仿/丙酮作 為洗脫劑分尚洗脫，先后分別獲得P_4, 8, 13-西柏二稀-1，3_二醇和a-4, 8, 13-西柏二 稀 _1，3_ 二醇。2. 根據(jù)權利要求1所述的煙草花序中提取西柏烷二萜的方法，其特征在于，所述步驟 (1)中：煙草花序的來源包括烤煙、晾曬煙、雪茄煙、白肋煙、香料煙或馬里蘭煙中的一種或 多種，煙葉花序選用生產中廢棄的新鮮的或干燥的煙葉花序。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的煙草花序中提取西柏烷二萜的方法，其特征在于，所述步 驟（1)中：浸提的具體方法為：將煙草花序依次在3個盛有二氯甲烷的容器中浸提，每個容 器中連續(xù)浸提兩次，每次ls_2s，浸提過程中，二氯甲烷顏色變黃褐時更換溶劑。4. 根據(jù)權利要求1或2所述的煙草花序中提取西柏烷二萜的方法，其特征在于，所述步 驟（2)中：去除水分的方式為向浸提液中加入無水硫酸鈉進行干燥處理，無水硫酸鈉吸收 浸提液中的水，成為水合硫酸鈉，干燥完全后過濾除去水合硫酸鈉。5. 根據(jù)權利要求1或2所述的煙草花序中提取西柏烷二萜的方法，其特征在于，所述步 驟（2)中：減壓濃縮的溫度為40°C。6. 根據(jù)權利要求1或2所述的煙草花序中提取西柏烷二萜的方法，其特征在于，所述步 驟（3)中：溶解的方法為攪拌或超聲。7. 根據(jù)權利要求1或2所述的煙草花序中提取西柏烷二萜的方法，其特征在于，所述步 驟（3)中：70%乙醇洗滌沉淀時，70%乙醇與沉淀的體積質量比為6-8:1。8. 根據(jù)權利要求1或2所述的煙草花序中提取西柏烷二萜的方法，其特征在于，所述步 驟（3)中：上清液的減壓濃縮溫度為50-60°C。9. 根據(jù)權利要求1或2所述的煙草花序中提取西柏烷二萜的方法，其特征在于，所述步 驟（3)中：石油醚層的減壓濃縮溫度為50-55°C。10. 根據(jù)權利要求1或2所述的煙草花序中提取西柏烷二萜的方法，其特征在于，所述 步驟（4)中：硅膠為200-300目。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從煙草花序中提取西柏烷二萜的方法。包括如下步驟：1.有機溶劑浸提、濃縮，獲得煙草花表面腺毛分泌物粗浸膏；2.粗浸膏采用溶劑沉淀法除去高級烷烴，并用活性炭除去色素，獲得煙草二萜提取物，該提取物對植物病原真菌具有廣譜抑制作用，尤其對蘋果腐爛病的抑制效果最好3.將獲得的二萜提取物依次通過硅膠柱層析，分離獲得兩種具有抗腫瘤、神經保護劑、抑菌等活性的主要二萜化合物：α-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇和β-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇。本發(fā)明的原料來自于廢棄煙草花序，實現(xiàn)了廢棄資源的利用；提取步驟大大簡化，節(jié)約了成本；且產物的得率和純度都很高。
【IPC分類】C07C29/76, C07C35/02
【公開號】CN105001052
【申請?zhí)枴緾N201510382060
【發(fā)明人】張忠鋒, 杜詠梅, 顏培真, 何小鳳, 侯小東, 段蘇珍, 付秋娟, 王愛華
【申請人】中國農業(yè)科學院煙草研究所
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年7月3日