一套用于炭疽桿菌檢測的多核苷酸、方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一套生物工程技術(shù)領(lǐng)域的質(zhì)粒分子，具體涉及一套用于炭疽桿菌檢測 的多核苷酸、方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 炭疽桿菌（Bacillusanthraci)歸屬于芽胞桿菌屬（Bacillus)。炭疽桿菌能引起 羊、牛、馬等動物及人類的炭疽病。炭疽桿菌曾被帝國主義作為致死戰(zhàn)劑之一。平時，牧民、 農(nóng)民、皮毛和屠宰工作者易受感染，故已引起世界多國相關(guān)部門的重視。
[0003] 目前炭疽桿菌的檢測方法分為兩類，一類是傳統(tǒng)的培養(yǎng)及其改進(jìn)方法，依賴于生 化與形態(tài)學(xué)特點，檢測周期較長，可操作性差；一類是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechain reaction，PCR)相關(guān)方法，包括普通PCR方法以及實時熒光PCR方法，主要是針對炭疽桿菌 區(qū)別于芽胞桿菌屬其它細(xì)菌的多個靶基因，選擇特異序列，建立PCR以及實時熒光PCR方 法。炭疽桿菌PCR相關(guān)檢測方法近年來發(fā)展迅速，由于其快速、靈敏、特異的特性，已經(jīng)成為 食源性病原微生物的可靠檢測方法。
[0004] 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一種含有檢測目的基因的特異性片段的重組質(zhì)粒分子，在 PCR定性檢測中可以作為陽性對照，在PCR定量分析中可以作為定量分析的標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建定 量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。目前質(zhì)粒DNA分子作為基因檢測的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)得到了越來越多的深入研 究和應(yīng)用，但是針對炭疽桿菌實時熒光PCR檢測方法的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)還是空白。在實 際炭疽桿菌實時熒光PCR時，各單位使用的多是自行設(shè)計構(gòu)建的質(zhì)粒DNA分子作為標(biāo)準(zhǔn)品， 其中的目的基因特異性片段各不相同，同時缺乏統(tǒng)一的定值方法，質(zhì)粒DNA分子定值準(zhǔn)確 度差，造成各實驗室之間的檢測結(jié)果差異極大，缺乏可比性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一套適用于炭疽桿菌實時熒光定量PCR檢測的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn) 分子及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一套分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含炭疽桿菌的 大分子毒素基因PA基因序列和/或炭疽桿菌的大分子莢膜基因capA基因序列。
[0007]在另一優(yōu)選例中，所述炭疽桿菌大分子毒素基因PA的基因序列選自下組：
[0008] (a)序列如SEQIDNO. : 3所示的多核苷酸序列；
[0009] (b)核苷酸序列與SEQIDNO. :3所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0010](C)序列與SEQIDNO. : 3所示多核苷酸完全匹配或完全互補(bǔ)并且長度為SEQID NO. : 3所示序列長度的20% -100% (較佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0011] (d)與（a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述炭疽桿菌的大分子莢膜基因capA基因序列選自下組：
[0013] (a)序列如SEQIDNO. :1所示的多核苷酸序列；
[0014] (b)核苷酸序列與SEQIDNO. : 1所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0015] (c)序列與SEQIDNO. :1所示多核苷酸完全匹配或完全互補(bǔ)并且長度為SEQID NO. :1所示序列長度的20% -100% (較佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0016] (d)與（a)-(C)任一所述的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸含有炭疽桿菌的大分子莢膜基因capA基因序列 和炭疽桿菌的大分子毒素基因PA序列，以及任選地連接兩種基因序列的接頭序列。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸序列如SEQIDNO. :3所示。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸序列如SEQIDNO. : 1所示。
[0020] 本發(fā)明的第二方面，提供了一套分離的DNA構(gòu)建物，所述DNA構(gòu)建物中包含本發(fā)明 第一方面所述的多核苷酸，以及任選的標(biāo)簽序列、酶切序列、啟動子序列和/或載體序列。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述DNA構(gòu)建物中包含炭疽桿菌的大分子莢膜基因capA基因序 列和炭疽桿菌的毒素PA的基因序列。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述DNA構(gòu)建物為線性DNA構(gòu)建物或環(huán)狀DNA構(gòu)建物。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述DNA構(gòu)建物為質(zhì)?；虮磉_(dá)載體。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)?；虮磉_(dá)載體作為炭疽桿菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)分子（質(zhì)粒標(biāo) 準(zhǔn)分子）。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述質(zhì)?；虮磉_(dá)載體的骨架質(zhì)粒選自下組：pUC19,pUC18， pUC118，pUC119，pBlueScriptIISK和pGEM。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述質(zhì)粒的序列如SEQIDNO:2或4所示。
[0027] 本發(fā)明的第三方面，提供了一套試劑盒，所述試劑盒中包括本發(fā)明第一方面所述 的多核苷酸或者本發(fā)明第二方面所述的DNA構(gòu)建物。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括引物對，所述引物對特異性擴(kuò)增炭疽桿菌 大分子毒素基因PA的基因序列。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，特異性擴(kuò)增炭疽桿菌大分子毒素基因PA的基因序列的所述的 引物對選自下組：
[0030]SEQIDNO. :5 和SEQIDNO. :6 所示的引物對；
[0031]SEQIDNO. :7 和SEQIDNO. :8 所示的引物對；
[0032]SEQIDNO. :9 和SEQIDNO. : 10 所示的引物對；和
[0033]SEQIDNO. : 11 和SEQIDNO. : 12 所示的引物對。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括引物對，所述所述引物對特異性擴(kuò)增炭疽 桿菌的大分子莢膜基因capA基因序列。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，特異性擴(kuò)增炭疽桿菌的大分子莢膜基因capA基因序列的引物 對選自下組：
[0036]SEQIDNO. : 14 和SEQIDNO. : 15 所示的引物對；
[0037]SEQIDNO. : 16 和SEQIDNO. : 17 所示的引物對；和
[0038]SEQIDNO. : 18 和SEQIDNO. : 19 所示的引物對。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括選自下組的探針序列，所述探針序列如SEQ IDNO. : 13 所示。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括選自下組的探針序列，所述探針序列如SEQ IDNO. : 20 所示。
[0041] 本發(fā)明的第四方面，提供了如本發(fā)明第一方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第二方面 所述的DNA構(gòu)建物、或本發(fā)明第三方面所述的試劑盒的用途，其特征在于，用于炭疽桿菌的 檢測。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測為非診斷或治療目的。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測為熒光定量PCR檢測。
[0044] 本發(fā)明的第五方面，提供了一套炭疽桿菌實時熒光定量PCR檢測方法，所采用的 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是如本發(fā)明第一方面所述的多核苷酸或本發(fā)明第二方面所述的DNA構(gòu)建物。
[0045] 本發(fā)明的第六方面，提供了一套多核苷酸產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括：
[0046] (i)炭疽桿菌標(biāo)準(zhǔn)品，所述的標(biāo)準(zhǔn)品選自：本發(fā)明第一方面所述的多核苷酸或者 本發(fā)明第二方面所述的DNA構(gòu)建物；
[0047] (ii)特異性擴(kuò)增炭疽桿菌序列的引物對，所述引物對為：
[0048]SEQIDNO. :7和SEQIDNO. :8所示的序列構(gòu)成的引物對；和/或
[0049]SEQIDNO. :9和SEQIDNO. : 10所示的序列構(gòu)成的引物對。
[0050]在另一優(yōu)選例中，所述的產(chǎn)品為多核苷酸的組合（combination)，較佳地所述組分 ⑴和（ii)是各自獨立的。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，所述的產(chǎn)品為試劑盒形式。
[0052] 本發(fā)明的第七方面，提供了 一套炭疽桿菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法，包括以下 步驟：
[0053] ①人工合成炭疽桿菌的毒素PA基因序列和/或炭疽桿菌的大分子莢膜基因capA 基因序列，所述炭疽桿菌的大分子莢膜基因capA基因序列和所述毒素PA表達(dá)基因序列分 別如SEQIDNO. : 1 和SEQIDNO:3 所示；
[0054] ②將步驟①所得基因序列克隆至克隆載體上，得到炭疽桿菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。
[0055] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟②所述克隆載體為pUC19,pUC18,pUC118,pUC119， pBlueScriptIISK或pGEM。
[0056] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟②所述克隆載體為pUC19。
[0057] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于