篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0058] 圖1是本發(fā)明質(zhì)粒標準分子PA的圖譜。
[0059] 圖2是本發(fā)明所得質(zhì)粒標準分子PA穩(wěn)定性檢測結果圖。
[0060] 圖3是利用本發(fā)明質(zhì)粒標準分子PA建立的實時熒光PCR標準曲線。
[0061] 圖4是本發(fā)明質(zhì)粒標準分子capA的圖譜。
[0062] 圖5是本發(fā)明所得質(zhì)粒標準分子capA穩(wěn)定性檢測結果圖。
[0063] 圖6是利用本發(fā)明質(zhì)粒標準分子capA建立的實時焚光PCR標準曲線。
【具體實施方式】
[0064] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，獲得一段能夠用于炭疽桿菌PCR檢測的多核苷 酸序列以及與之相配合的引物對，實驗結果表明，采用合適的骨架質(zhì)粒將所述多核苷酸序 列制備為標準質(zhì)粒分子，并配合本發(fā)明的引物對進行實時熒光PCR檢測，具有極佳的特異 性和靈敏度，并且穩(wěn)定性良好。
[0065] 本發(fā)明所要解決的技術問題是為了克服現(xiàn)有的炭疽桿菌實時熒光PCR檢測方法 中缺乏陽性標準品和陽性標準品配置的問題，提供了一套適用于炭疽桿菌實時熒光PCR檢 測的質(zhì)粒標準分子以及該質(zhì)粒標準分子的構建方法、定量方法和應用。
[0066] 檢測菌株
[0067] 炭疽（anthrax)由炭疽芽孢桿菌（Bacillusanthracis)引起的人獸共患病，是 牧區(qū)食草動物的一種常見疾病。炭疽芽胞桿菌與其他同源蠟樣桿菌屬的區(qū)別在于兩個毒性 質(zhì)粒，即編碼炭疽毒素的PXOl質(zhì)粒和編碼莢膜合成酶的pX02質(zhì)粒。由于炭疽芽孢在環(huán)境 中抵抗力極強，在軍事上一直被列為是頭號生物戰(zhàn)劑。快速檢驗和鑒定炭疽芽孢桿菌無論 是對人和食草動物炭疽病診斷還是應對可能出現(xiàn)的生物恐怖襲擊都十分重要。
[0068] 近年發(fā)展起來的定量PCR檢驗診斷技術為快速診斷該病提供了手段。本研究采用 TaqMan實時熒光定量PCR技術，以pXOl質(zhì)粒上的PA基因、pX02質(zhì)粒上的capA基因。因 此，它們可以作為炭痕桿菌菌種檢測的關鍵基因。
[0069] 實時熒光PCR檢測炭疽桿菌的原理
[0070] 采用實時熒光PCR技術可特異性擴增炭疽桿菌基因組DNA中毒素PA基因序列或 炭疽桿菌大分子莢膜基因capA基因序列，設計針對以上靶基因的引物和兩端標記熒光的 探針，擴增測試樣品DNA。實時熒光PCR可以通過檢測熒光信號的增加來實時監(jiān)測PCR產(chǎn) 物。與此同時，用相同的引物、探針和條件擴增已知濃度的陽性標準物質(zhì)（或陽性標準分 子）。PCR方法中，陽性標準物質(zhì)（或陽性標準分子）可以作為陽性對照；實時熒光PCR中， 陽性標準物質(zhì)（或陽性標準分子）可以構建穩(wěn)定的標準曲線，根據(jù)標準曲線可分別計算出 樣品中對應基因的絕對含量（拷貝數(shù)或濃度）。
[0071] 標準物質(zhì)
[0072] 標準物質(zhì)是具有一套或多種足夠均勻和很好確定了的特性值，用以校準設備，評 價測量方法或給材料賦值的材料或物質(zhì)。
[0073] 質(zhì)粒標準分子
[0074] 本發(fā)明中涉及兩種檢測炭疽桿菌的特異性序列并在此基礎上設計了兩種質(zhì)粒標 準分子，一種炭疽桿菌的特異性序列是炭疽桿菌毒素PA基因，長度為2227bp;另一套炭疽 桿菌的特異性序列是炭疽桿菌大分子莢膜基因capA基因，長度為1236bp。
[0075] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施方式中，本發(fā)明提供了一套炭疽桿菌的質(zhì)粒標準分 子，該質(zhì)粒標準分子包含炭疽桿菌大分子莢膜基因capA基因序列，所述炭疽桿菌大分子莢 膜基因capA基因序列如序列表中SEQIDNO:1所示：
[0076]
[0077](SEQIDNO. : 1)。
[0078] 本發(fā)明的質(zhì)粒標準分子，較佳地含有炭疽桿菌的PCR檢測的靶基因炭疽桿菌大分 子莢膜基因capA基因序列。
[0079] 本發(fā)明中所述的炭疽桿菌大分子莢膜基因capA基因，在DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成 中起作用，它可作為炭疽桿菌檢測的一套靶基因，所述炭疽桿菌大分子莢膜基因capA基因 的序列較佳的如SEQIDNO:1所示。
[0080] 本發(fā)明所述的質(zhì)粒標準分子的序列較佳的如SEQIDNO:2所示，其中第402位到 第1637位為capA基因序列：
子，該質(zhì)粒標準分子包含炭疽桿菌毒素PA表達基因序列，所述炭疽桿菌毒素PA表達基因序 列如序列表中SEQIDNO:3所示：
[0085]
[0086](SEQIDNO. : 3)。
[0087] 本發(fā)明的質(zhì)粒標準分子，較佳地含有炭疽桿菌的PCR檢測的靶基因炭疽桿菌毒素 PA表達基因序列。
[0088] 本發(fā)明中所述的炭疽桿菌毒素PA表達基因，在DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成中起作 用，它可作為炭疽桿菌檢測的一套靶基因，所述炭疽桿菌毒素PA的序列較佳的如SEQID NO: 3所示。
[0089] 在本發(fā)明的另一個較佳的實施方式中，本發(fā)明所述的質(zhì)粒標準分子的序列如SEQ IDNO:4所示，其中第423位到第2649位為PA基因序列：
[0090]
[0093](SEQIDNO. : 4)。
[0094] 在本發(fā)明的另一較佳的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒標準分子中含有炭疽桿菌 大分子莢膜基因capA基因序列和炭疽桿菌毒素PA基因序列。較佳地，所述capA序列如 SEQIDNO. : 1所示，所述PA序列如SEQIDNO. : 3所示。
[0095] 本發(fā)明中如上所述炭疽桿菌的質(zhì)粒標準分子的定量方法，其包括以下步驟：
[0096] ①提取質(zhì)粒標準分子；
[0097] ②根據(jù)步驟①所得的質(zhì)粒標準分子的堿基組成和序列長度，計算質(zhì)粒標準分子中 的磷元素的含量；
[0098] ③配制梯度濃度的磷標準溶液，并用此標準溶液作出高分辨電感耦合等離子體發(fā) 射質(zhì)譜的標準曲線；
[0099] ④高分辨電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜檢測質(zhì)粒標準分子溶液，并根據(jù)步驟③所得 的標準曲線得出質(zhì)粒標準分子溶液的磷含量；
[0100] ⑤根據(jù)步驟④所得的質(zhì)粒標準分子溶液的磷含量和步驟②所得的質(zhì)粒標準分子 中的磷元素的含量，計算出質(zhì)粒標準分子的濃度。
[0101] 其中步驟所述③高分辨電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜檢測的條件如下：冷卻氣流 量較佳地為l〇L/min~25L/min，最佳地為16. 86L/min，輔助氣流量較佳地為0. 5L/min~ 3.OL/min，最佳地為0. 88L/min，霧化氣流量為較佳地為0. 5L/min~2. 43L/min，更佳地為 I. 123L/min，功率較佳地為1200W~1400W，最佳地為1350W。
[0102] 本發(fā)明所述質(zhì)粒標準分子的定量方法較佳地包括紫外分光光度法和高分辨電感 耦合等離子體質(zhì)譜（HR-ICP-MS)。
[0103] 具體實施說明：
[0104] 本發(fā)明所述質(zhì)粒標準分子的定量方法較佳地包括紫外分光光度法和高分辨電感 耦合等離子體質(zhì)譜（HR-ICP-MS)。
[0105] 其中紫外分光光度法對質(zhì)粒標準分子定量方法較佳地包括以下步驟：
[0106] ①提取質(zhì)粒標準分子；
[0107] ②用TE緩沖液使紫外分光光度計校正為零點；
[0108] ③取適量DNA(根據(jù)儀器的需要）至比色杯中（nanodrop直接點在檢測區(qū)域），記 錄儀器讀數(shù)。
[0109] ④若可直接讀出DNA濃度則直接記錄；若不可，則記錄樣品在260nm和280nm的光 密度，DNA樣品的濃度為0D260X核酸稀釋倍數(shù)X50,濃度單位為ng/yL。
[0110] (2)HR-ICP-MS對質(zhì)粒標準分子定量方法較佳地包括以下步驟：
[0111] ①提取質(zhì)粒標準分子；
[0112] ②根據(jù)質(zhì)粒標準分子的堿基組成和序列長度，分別計算各質(zhì)粒標準分子的磷元素 的含量；
[0113] ③配制梯度濃度的磷標準溶液，并用此標準溶液作出HR-ICP-MS的標準曲線。
[0114] ④HR-ICP-MS檢測質(zhì)粒標準分子，并根據(jù)標準曲線得出質(zhì)粒標準分子的磷含量。
[0115] ⑤根據(jù)質(zhì)粒標準分子的磷含量計算出質(zhì)粒標準分子的濃度。
[0116] 本發(fā)明還提供了一套炭疽桿菌實時熒光定量PCR檢測方法，其所采用的標準物質(zhì) 是如上所述的質(zhì)粒標準分子。
[0117] 本發(fā)明還提供了一套如上所述的炭疽桿菌的質(zhì)粒標準分子的制備方法，包括以下 步驟：
[0118] ①人工合成所述炭疽桿菌的特異性序列，所述序列如SEQ ID NO :1和/或3所示；
[0119] ②將步驟①所得炭疽桿菌的序列克隆至克隆載體上，得到炭疽桿菌的質(zhì)粒標準分 子。
[0120] 其中步驟①所述的人工合成的方法較佳地為：全基因合成或者PCR引物擴增的方 法獲得該序列。
[0121] 本發(fā)明所述質(zhì)粒標準分子構建方法較佳地包括以下步驟：
[0122] ①NCBI(美國國立生物技術信息中心）的Genbank中查詢炭疽桿菌的大分子毒素 基因PA基因和/或大分子莢膜基因capA基因；
[0123] ②對上述序列進行分析，選擇合適的序列和合適的酶切位點，并將酶切位點