一種縮氨脲類化合物的制備方法和在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化學(xué)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及化合物及其制備方法和應(yīng)用，更具體 的，本發(fā)明涉及式I所示化合物以及衍生物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 銅鋅超氧化物歧化酶（SODl)是一種生物體內(nèi)具有重要抗氧化功能的金屬酶，金 屬輔基鋅和銅決定該酶的結(jié)構(gòu)和活性。Cu2+直接參與催化反應(yīng)，而Zn 2+維持酶的構(gòu)象，不直 接參與反應(yīng)；但Cu2+和Zn2+對(duì)于SODl結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是不可或缺的，螯合劑與SODl相互作用 后，形成脫輔基的SODl，其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，加入過(guò)量的Zn2+可以使SODl的結(jié)構(gòu)恢復(fù)，但Cu 2+是不可替代的，否則SODl將失去催化活性。金屬結(jié)合部位的環(huán)境被破壞，SODl的整體結(jié)構(gòu) 及功能都可能發(fā)生變化。
[0003]目前關(guān)于SODl與人類疾病之間的關(guān)系研究最廣泛的是肌萎縮脊髓側(cè)硬化癥 (Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)，該病目前尚無(wú)有效治療的方法和藥物，為全球五 大絕癥之一（另外四種為癌癥、艾滋病、敗血癥以及類風(fēng)濕）^3ALS是一種導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死 亡的致死性神經(jīng)退行性疾病，隨著疾病的發(fā)展，大腦和脊髓中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元收縮甚至消失， 肌肉因不能收到運(yùn)動(dòng)信號(hào)而萎縮，患者脊髓側(cè)索部位逐漸變硬，身體隨之麻痹甚至癱瘓，故 又稱ALS為"漸凍癥"。據(jù)新華網(wǎng)搜索結(jié)果顯示，我國(guó)目前至少有20萬(wàn)名ALS患者，遠(yuǎn)高于 全世界約5/100, 000的平均患病率。ALS病理過(guò)程對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損傷涉及多種原因，大量 證據(jù)表明SODl過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥，損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，從而導(dǎo)致ALS。
[0004] 同時(shí)，已經(jīng)有大量研究結(jié)果表明體內(nèi)活性氧自由基過(guò)多會(huì)引起機(jī)體組織中細(xì)胞 損傷，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生和發(fā)展，甚至死亡。因此，要對(duì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，R0S，主要是02'和H2O2)相對(duì)濃度進(jìn)行有效的調(diào)控，此調(diào)控的關(guān)鍵之一是合理抑 制SODl的活性。目前該酶最有效的抑制劑是銅螯合劑，這主要是因?yàn)殂~螯合劑通過(guò)奪取 SODl活性部位中的銅，從而使其失活。
[0005] 銅作為人體必須的微量元素之一，維持其在體內(nèi)平衡十分重要。微量元素銅在 人體細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要生理功能，維持細(xì)胞內(nèi)銅的穩(wěn)態(tài)平衡，其代謝也至關(guān)重要。銅代謝紊 亂能引發(fā)多種疾病，如阿爾茨海默氏癥（Alzheimer' s disease，AD)、Menkes病（Menkes disease，MD)、威爾森氏癥（Wilson' s Disease，WD)等。
[0006] AD是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶力下降、思維能力下降、行為異 常、性格改變等。Menkes?。∕enkes disease，MD)又稱卷發(fā)綜合征，是一種先天性銅代謝 異常疾病。威爾森氏癥（Wilson' s Disease，WD)是由于ATP7B基因突變導(dǎo)致銅轉(zhuǎn)運(yùn)障礙 而引起的，是一種常染色體隱性遺傳性銅蓄積性疾病。
[0007] 目前對(duì)于螯合劑類SODl抑制劑的研究和報(bào)導(dǎo)主要集中在四硫代鉬酸鹽（MoS42， 如TM，衍生物ATN224等）和二乙胺二硫代氨基甲酸鹽（如DDC)兩類。四硫代鉬酸鹽類 (MoS42)螯合劑與金屬離子具有很強(qiáng)結(jié)的螯合能力，是一種可口服的銅螯合藥物，被認(rèn)為能 夠有效治療銅代謝紊亂病癥，但與銅離子形成的配合物在體內(nèi)不易代謝。MoS42在抗癌細(xì)胞 增殖和抗血管生成治療中已完成二期臨床實(shí)驗(yàn)。MoS42的抗癌活性源于螯合SODl中的銅從 而抑制S0D1，即SODl是MoS42抗癌的主要作用靶標(biāo)，主要通過(guò)螯合細(xì)胞膜上銅傳輸?shù)鞍字?的銅離子，阻斷新合成的SODl獲得銅離子而活化，從而降低胞內(nèi)的SODl的活性。二乙基 二硫代氨基甲酸鈉（DDC)是SODl的抑制劑，研究表明，DDC能夠螯合溶液里SODl中77%的 銅和44%的鋅，使SODl失去催化活性，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入一定量的DDC有明顯抑制癌細(xì) 胞分裂、增殖的作用。然而同時(shí)也發(fā)現(xiàn)MoS42和DDC對(duì)SODl活性的抑制缺乏特異性，對(duì)胞 內(nèi)其它含銅蛋白的活性影響較為明顯，例如MoS42在抑制SODl活性的同時(shí)能明顯抑制細(xì)胞 色素 c氧化酶的活性。另外，MoS42和DDC對(duì)銅離子的螯合能力過(guò)于強(qiáng)大導(dǎo)致破壞胞內(nèi)銅離 子的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，螯合形成的銅配合物在體內(nèi)不易代謝，在體內(nèi)富集造成二次傷害。
[0008] 已有研究報(bào)道的螯合劑作為SODl活性抑制劑僅上述2例，它們雖然能有效的抑制 SODl活性，但存在明顯的缺陷：（1)帶負(fù)電荷，無(wú)法跨越血腦屏障和細(xì)胞膜；（2)缺乏特異 性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)其它含銅蛋白活性受到不同程度的影響。目前的研究結(jié)果還不能表明這兩 類螯合劑能選擇性地螯合SODl中的銅離子使SODl失活。
[0009] 目前在細(xì)胞內(nèi)能夠特異性抑制SODl活性的抑制劑尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)?，F(xiàn)有研究的螯合 劑類SODl抑制劑雖然能抑制其酶活性，但存在的缺陷亦十分明顯，甚至成為后期藥物研發(fā) 中的技術(shù)瓶頸。因此有必要開(kāi)發(fā)抑制效果明顯、毒副作用小、特異性顯著的新型SODl抑制 劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明的 目的在于提出一類具有SODl抑制劑用途的化合物。
[0011] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種化合物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該化合物為式 I所示化合物或式I所示化合物的對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的 鹽、結(jié)晶水合物或溶劑合物，
[0012]
[0013] 其中，
[0014] X為硫或氧；
[0015] R1和R2分別獨(dú)立地為氫，含有1~3個(gè)碳原子的烷基或N = CHR 5,其中R5為任選 取代的芳香基或任選取代的烷基；
[0016] R3和R4分別獨(dú)立地為氫或含有1~3個(gè)碳原子的烷基或選自式II、III、IV、V所 示取代基：
[0017]
[0018] 其中，
[0019] X1為硫或氧；
[0020] Y31和Y2分別獨(dú)立地為氫、含有1~3個(gè)碳原子的烷基、鹵素、羥基、甲氧基、氨基、 磺酸基、硝基、羧基、巰基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基或者二乙氨基中的至少一個(gè)；
[0021] Z1為氫、含有1~3個(gè)碳原子的烷基、鹵素、羥基、氨基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基 或者二乙氨基；
[0022] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過(guò)配合物穩(wěn)定常數(shù)計(jì)算、配合物的 結(jié)構(gòu)分析及細(xì)胞跨膜實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述通式（I )所示系列化合物容易穿透細(xì)胞 膜進(jìn)入細(xì)胞，且對(duì)銅離子有良好的螯合能力，形成的配合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對(duì)正常細(xì)胞系毒性較 低。因此本發(fā)明提供了通式（I )所示系列化合物在治療銅代謝紊亂藥物中的應(yīng)用。所述銅 代謝紊亂病癥為阿爾茨海默氏癥（Alzheimer's disease，AD)、Menkes?。∕enkes disease， MD)及威爾森氏癥（Wilson' s Disease，WD) 〇
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述化合物還可以具有下列附加技術(shù)特征：
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述鹵素為F、Cl或Br。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述R1和R2分別獨(dú)立地為至少一個(gè)氫，R 5為苯基、 4-甲基苯基、2_羥基苯基、3_羥基苯基、4_羥基苯基、2_羥基_5_氣苯基、2_羥基_4_氣苯 基、3_甲氧基苯基、4_氣苯基、2_氣苯基、2, 4_二氣苯基、3_漠苯基、4_漠苯基、4_氣苯基、 3-氟苯基、4-三氟甲基苯基、吡咯、鄰位吡啶、間位吡啶、對(duì)位吡啶。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述R3、R4和R 5分別獨(dú)立地為含有1~3個(gè)碳原子 的烷基。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述化合物為下列化合物或者所述下列化合物的對(duì) 映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體、外消旋體、藥學(xué)上可接受的鹽、結(jié)晶水合物或溶劑合物：
[0028]
[0029] 在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種制備前面所述化合物的方法，根據(jù)本發(fā) 明的實(shí)施例，該方法包括：
[0030] 使式A所示化合物在第一有機(jī)溶劑中與式IIA，IIIA，IVA或VA所示化合物接觸以 便獲得式I所示化合物；
[0031]
[0032]

[0033] 其中所述R1和R 2分別獨(dú)立地為氫，含有1~3個(gè)碳原子的烷基、R ?χα^Υ』1、 Y2和Z1是如是如前面所描述的。
[0034] 任選地，第一有機(jī)溶劑為DMSO、DMF、乙腈、異丙醇中的至少一種；
[0035] 任選地，所述接觸是式ΙΙΑ，ΙΙΙΑ，IVA或VA所示化合物的第一有機(jī)溶劑溶液滴加 至式A所示化合物和第一有機(jī)溶劑的溶液中，滴加速率不大于l.OmL/min ;
[0036] 任選地，重結(jié)晶提純，所述重結(jié)晶提純的溶劑為DMF或DMSO與水的混合溶劑；
[0037] 任選地，所述重結(jié)晶提純步驟中水為去離子水。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法進(jìn)一步包括：
[0039] (1)使式A'所示化合物在第二有機(jī)溶劑和水的混合溶劑中與式B所示化合物接 觸，以便獲得式C所示化合物；
[0040] (2)使所述式C所示化合物在第一有機(jī)溶劑中分別與式IIA，IIIA，IVA或VA所示 化合物接觸以便獲得式I所示化合物；
[0042] 其中所述R1和R2分別獨(dú)立地為氫，含有1~3個(gè)碳原子的烷基且至少一個(gè)為N = CHR5、R3、R4、X、X1、Y、Y 1、Y2和Z 1是如前面所描述的
[0043] 任選地，第一有機(jī)溶劑為DMSO、DMF、乙腈、異丙醇中的至少一種；
[0044] 任選地，第二有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、DMF、乙腈、DMSO中的至少一種；
[0045] 任選地，所述步驟（2)中反應(yīng)溫度為20-80°C
[0046] 任選地，所述步驟（2)中接觸是式IIA，IIIA，IVA或VA所示化合物的第一有機(jī)溶 劑溶液滴加至式A所示化合物和第一有機(jī)溶劑的溶液中，滴加速率不大于l.OmL/min ;
[0047] 任選地，重結(jié)晶提純，所述重結(jié)晶提純的溶劑為DMF或DMSO與水的混合溶劑；
[0048] 任選地，所述重結(jié)晶提純步驟中水為去離子水。
[0049] 由此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提出了一條合成路線，可以用于制備式I所示 化合物1 :
[0053] 步驟1，室溫下將過(guò)量硫代卡巴肼溶于乙醇/水混合溶劑中，加熱至60_90°C全部 溶解。再用恒壓滴管將5-氯水楊醛的乙醇溶液緩慢滴加到上述溶液。滴加催化量的冰醋 酸并恒溫反應(yīng)l_2h，得到白色不溶物，抽濾，收集并用乙醇、去離子水淋洗，干燥。
[0054] 步驟2,將三氯氧磷在冰浴條件下緩慢滴加到DMF中，然后再將鄰羥基苯乙酮的 DMF溶液以低于1.0 mL/min的速率緩慢滴加至混合液中，升溫至25°C反應(yīng)10h，反應(yīng)結(jié)束后 冷卻至室溫。將反應(yīng)混合物倒入冰水中，將產(chǎn)生的黃色沉淀抽濾，純化得白色晶體。
[0055] 步驟3,將步驟2所得產(chǎn)物溶于DMSO中，依次加入步驟1所得產(chǎn)物及催化量冰醋 酸，45°C反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后在室溫下加入3-5倍體積去離子水，將沉淀物過(guò)濾，并先后用 去離子水、無(wú)水乙醇（甲醇）淋洗2-3遍，干燥得到初產(chǎn)品。將初產(chǎn)品溶于DMSO中，在試管 中緩慢滴加去離子水，靜置擴(kuò)散，重結(jié)晶析出針狀晶體。
[0056] 在本發(fā)明的第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了前面所述的化合物或（SODl)活性抑制劑 或者在制備藥物中的用途，在制備銅鋅超氧化物歧化酶（SODl)活性抑制劑的用途，任選 地，所述銅鋅超氧化物歧化酶（SODl)活性調(diào)控胞內(nèi)活性氧（ROS)濃度水平，任選地，所述活 性氧（ROS)為O2'及H2O2?；衔锟梢杂糜谥苽渌幬镏?，所述藥物用于治療上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 和下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷、神經(jīng)細(xì)胞康復(fù)治療以及治療慢性退行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，任選地， 所述神經(jīng)退行性疾病為肌萎側(cè)索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)。所述藥 物用于治療或輔助治療銅代謝紊亂病癥，任選地，所述銅代謝紊亂病癥為阿爾茨海默氏癥 (Alzheimer' s disease，AD)、Menkes ?。∕enkes disease，MD)及威爾森氏癥（Wilson' s Disease, WD) 〇
[0057] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過(guò)SODl活性抑制試驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)SODl活性抑制試驗(yàn)，發(fā) 現(xiàn)本發(fā)明所述通式I所示化合物通過(guò)螯合金屬離子抑制SODl的活性。細(xì)胞內(nèi)的SODl活性 抑制試驗(yàn)進(jìn)一步證明該類化合物能有效的抑制細(xì)胞內(nèi)SODl的活性。因此，本發(fā)明提供的通 式I所示化合物在抑制SODl活性，治療神經(jīng)元疾病藥物研發(fā)中有良好的應(yīng)用前景。所述神 經(jīng)性疾病為肌萎側(cè)索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS) ο
[0058] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS)濃度水平的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn) Η202的水平相對(duì)于對(duì)照組明顯降低，且H2O2的濃度水平變化與加入的目標(biāo)化合物濃度呈遞 度遞減關(guān)系；同時(shí)，胞內(nèi)〇2'水平的變化也隨優(yōu)選化合物濃度梯度的遞增十分明顯。通過(guò) 分析胞內(nèi)活性氧R0S(02'和H2O2)濃度變化隨優(yōu)選化合物濃度之間的關(guān)系，證實(shí)本發(fā)明所述 縮氨脲類化合物能夠調(diào)控胞內(nèi)活性氧R0S(02'和H2O2)的濃度水平。因此，本發(fā)明提供的通 式I所示化合物在調(diào)控胞內(nèi)活性氧（〇2'和H2O2)水平的藥物研發(fā)方面有良好的應(yīng)用前景。
[0059] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)細(xì)胞線粒體中的細(xì)胞色素 C氧化酶活性的測(cè)試， 發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述通式I所示化合物在顯著抑制SODl酶活性的同時(shí)不影響細(xì)胞色素 c氧化 酶的活性。因此，本發(fā)明提供的通式I所示化合物在抑制SODl活性的同時(shí)不影響其它含銅 蛋白活性，即說(shuō)明通式I所示化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)銅離子的傳輸途徑?jīng)]有影響。
[0060] 本發(fā)明所述通式I所示縮氨基硫脲類化合物可以作為銅鋅超氧化物歧化酶 (SODl)抑制劑和可能在治療銅代謝紊亂藥物上的潛在應(yīng)用，具有調(diào)控體內(nèi)活性氧（R0S，主 要為〇2'及H2O2)水平的作用。本發(fā)明通式I所示化合物制備方法，操作簡(jiǎn)單，原料易得，反 應(yīng)條件溫和，提純方便，可用于通式I所示縮氨脲類化合物的大量制備。
【附圖說(shuō)明】