醇溶液 中，恒溫60°C反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后減壓抽濾，濾渣用乙醇洗滌，得白色粉末。
[0187] 步驟3 :將步驟2的產(chǎn)物（lOmmol，I. 42g)溶于CH2Cl2，分別加入一定量的縮合劑 4_二甲氨基吡啶和EDC，待固體完全溶解后加入乙醇。常溫反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后減壓抽濾， 硅膠柱層析純化得白色粉末。
[0188] 步驟4 :將水合肼緩慢滴加到上述步驟3所得產(chǎn)物（0. 002mol，0. 34g)的乙醇溶液 中，恒溫80°C回流反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫過濾，濾渣用乙醇洗滌，得到白色粉末。
[0189] 步驟5 :將步驟4的產(chǎn)物（I. 3mmol，0. 20g)和步驟1的產(chǎn)物（I. 3mmol， 0.225g)加入到乙醇中溶解，乙酸催化下恒溫80°C回流12h，反應(yīng)結(jié)束后過濾，濾渣用 乙醇洗滌，重結(jié)晶得到白色固體 〇· 35g。MS-ESI :298. 46 (M+H+)，1H NMR(400MHz, dmso) δ 11. 28(s, 1H), 10. 30(d, J = 12. 5Hz, 2H), 8. 48 (s, 1H), 7. 94 (s, 1H), 2. 81 (t, J = 8. 4Hz, 2H), 2. 45 (t, J = 8. 4Hz, 2H), 2. 17 (d, J = 5. 4Hz, 6H).
[0190] 實施例18:
[0191] 化合物18
[0192] N-methyl-2-(-3-(2-(6-〇x〇-l, 4,5, 6-tetrahydropyridazine-3-carbonyl) hydrazono)butan-2-ylidene)hydrazine-1-carbothioamide 的制備
[0193]
[0194] 反應(yīng)方程式同實施例17所示，對應(yīng)原料替換為4-甲基-3-氨基硫脲。
[0195] 步驟1 :在冰浴條件下將4-甲基-3-氨基硫脲（15mm〇l，I. 57g)的水溶液緩慢滴 加到過量的2,3_ 丁二酮中，室溫反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，濾渣用去離子水洗滌，得白色粉 末。
[0196] 步驟2 :將上述步驟1所得產(chǎn)物和實施例14步驟4所得產(chǎn)物等比例的加入到乙 醇中溶解，乙酸催化下恒溫80°C回流12h，反應(yīng)結(jié)束后過濾，濾渣用乙醇洗滌，重結(jié)晶得到 白色固體 I. 65g。MS-ESIdUJO(I^H+)ZH NMR (600MHz，dmso) δ 11.26 (s，lH)，10.30 (d，J =23. 0Hz, 2H), 8. 45 (s, 1H), 3. 14 - 3. 12 (m, 1H), 3. 03 (d, J = 4. 6Hz, 3H), 2. 81 (t, J = 8. 5Hz, 2H), 2. 45 (t, J = 8. 4Hz, 2H), 2. 19 (d, J = 29. 4Hz, 6H).
[0197] 實施例19:
[0198] 化合物19
[0199] 2-(-3-(2-(6-〇x〇-l, 4, 5, 6-tetrahydropyridazine-3-carbonyl)hydrazono) butan-2-ylidene)hydrazine-1-carboxamide 的制備
[0200]
[0201] 反應(yīng)方程式同實施例17所示，對應(yīng)原料替換為氨基脲。
[0202] 步驟1 :在冰浴條件下將氨基脲（15mm〇l，I. 13g)的水溶液緩慢滴加到過量的2， 3_ 丁二酮中，室溫反應(yīng)Ih，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，濾渣用二次水洗滌，得白色粉末。
[0203] 步驟2 :將上述步驟1所得產(chǎn)物和實施例14步驟4所得產(chǎn)物等比例的加入到乙醇 中溶解，乙酸催化下恒溫80°C回流10h，反應(yīng)結(jié)束后過濾，濾渣用乙醇洗滌，重結(jié)晶得到白 色固體 I. 21g。MS-ESI :281. 20/H NMR(400MHz，dmso) δ 11. 24(S，1H)，10. 19(s，1H)，9. 53( s, 1H), 6. 54 (s, 2H), 2. 80 (t, J = 8. 4Hz, 2H), 2. 44 (t, J = 8. 5Hz, 2H), 2. 15 (s, 3H), 2. 04 (s, 3H).
[0204] 實施例20:
[0205] 化合物20
[0206] Ν' - (-3 - (2 - (2 - (-5-chloro_2-hydroxybenzylidene) hydrazine-1-carbonothioyl)hydrazono)butan-2-ylidene)-6-oxo-l, 4, 5, 6-tetrahydro pyri daz ine-3-carbohydraz i de 的制備
[0207]
[0208] 反應(yīng)方程式同實施例17所示，對應(yīng)原料替換為硫代氨基脲及5-氯水楊醛。
[0209] 步驟1 :在冰浴條件下將實施例1步驟1所述產(chǎn)物的水溶液緩慢滴加到過量的2， 3_ 丁二酮中，室溫反應(yīng)Ih，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，濾渣用二次水洗滌，得白色粉末。
[0210] 步驟2 :將上述步驟1所得產(chǎn)物和實施例14步驟4所得產(chǎn)物等比例的加入到乙醇 中溶解，乙酸催化下恒溫80°C回流10h，反應(yīng)結(jié)束后過濾，濾渣用乙醇洗滌，重結(jié)晶得到白 色固體。MS-ESI :451. 10 (M+H+)，1H NMR(600MHz, dmso) δ 12.07 (s, 1H), 11.26 (d, J = 27·8Ηζ ,3H), 8. 66 (s, 1H), 7. 58 (s, 2H), 7. 31 (d, J = 8. 9Hz, 2H), 6. 94 (d, J = 8. 7Hz, 2H), 2. 81 (t, J =8. 5Hz, 3H), 2. 46 (t, J = 8. 4Hz, 3H).
[0211] 實施例21:
[0212] 化合物21
[0213] N，-(-3-(2-(2-(-2-hydroxybenzylidene) hydrazine-1-carbonothioyl) hydrazono)butan-2-ylidene)-6-oxo-l, 4, 5, 6-tetrahydropyridazine-3-carbohydrazi de的制備。
[0214]
[0215] 反應(yīng)方程式同實施例17所示，對應(yīng)原料替換為硫代氨基脲及水楊醛。
[0216] 步驟1 :在冰浴條件下將實施例2步驟1所述產(chǎn)物的水溶液緩慢滴加到過量 的2, 3-丁二酮中，室溫反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，濾渣用二次水洗滌，得白色粉末。步 驟2 :將上述步驟1所得產(chǎn)物和實施例14步驟4所得產(chǎn)物等比例的加入到乙醇中溶 解，乙酸催化下恒溫80°C回流10h，反應(yīng)結(jié)束后過濾，濾渣用乙醇洗滌，重結(jié)晶得到白 色固體。MS-ESI :417. 15 (M+H+)/H NMR(600MHz，dmso) δ 11. 99 (s, 1H), 11. 28 (d, J = 8. 9Hz, 2H), 8. 68(s, 1H), 7. 45(d, J = 7. 2Hz, 1H), 7. 29 (t, J = 7. 6Hz, 1H), 6. 91 (t, J = 8. 0Hz, 2H), 2. 81 (t, J = 8. 4Hz, 2H), 2. 45 (t, J = 8. 4Hz, 2H).
[0217] 實施例22:
[0218] 優(yōu)選目標(biāo)化合物在溶液中與銅離子形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)測試及計算。應(yīng)注意， 本實施例中所列舉的6例優(yōu)選化合物的實驗數(shù)據(jù)及結(jié)論僅作為驗證目的。
[0219] 1，實驗儀器：
[0220] UV紫外-可見分光光度計（Analytik-jena SPEC0RD-210);瑞士萬通877自動電 位滴定儀，精度〇.〇〇〇 ImL
[0221] 2,試驗方法：
[0222] 取實施例合成的目標(biāo)化合物，先用紫外吸收光譜滴定確定目標(biāo)化合物與銅離子的 結(jié)合比，然后再根據(jù)二者在溶液中的結(jié)合比例，用已標(biāo)定的NaOH溶液進(jìn)行pH-電位滴定。
[0223] 氫氧化鈉濃度的標(biāo)定和0)2校正：精確稱取30.0 Omg鄰苯二甲酸氫鉀并加入滴定 杯中，加入25mL雙蒸水?dāng)嚢枞芙?。將電極及滴定管插入溶液中，通入氮?dú)鈒Omin，同時設(shè)定 滴定參數(shù)，在等量滴定模式下，開始滴定，滴定儀會自動記錄下每次加〇. 〇〇2mL氫氧化鈉溶 液后溶液的PH，滴定到達(dá)第一個化學(xué)計量點（SP)后自動停止。停止滴定后儀器屏幕上自動 顯示出SP的pH以及到達(dá)SP時所滴加的氫氧化鈉溶液體積，利用此數(shù)值和加入的鄰苯二甲 酸氫鉀的質(zhì)量計算出氫氧化鈉的濃度。平行滴定3次，計算結(jié)果取平均值（偏差〈0. 5% )。 本滴定數(shù)據(jù)也被直接用于進(jìn)行CO2校正。
[0224] 硝酸濃度的標(biāo)定：定量移取2mL硝酸溶液到滴定杯中，方法同上。標(biāo)定硝酸溶液的 濃度，平行滴定至少3次，計算結(jié)果取平均值（偏差〈0. 5% )。
[0225] 目標(biāo)化合物離解常數(shù)的測定：向滴定杯中加入計算量目標(biāo)化合物溶液、硝酸溶液、 硝酸鉀溶液及雙蒸水，使混合溶液中目標(biāo)化合物濃度為〇. 0001-0.0 Olmol/L(根據(jù)目標(biāo)化 合物溶解度選擇最優(yōu)濃度），硝酸濃度為〇. 〇〇lmol/L，離子強(qiáng)度為0. lmol/L硝酸鉀，溶液總 體積為25mL。在25. 0±0. 1°C恒溫和氮?dú)獗Ｗo(hù)下，選擇動態(tài)滴定模式，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液進(jìn) 行滴定，平行滴定至少三次，記錄滴定結(jié)果。目標(biāo)化合物合銅配合物逐級穩(wěn)定常數(shù)的測定： 向滴定杯中加入計算量目標(biāo)化合物溶液、硝酸溶液、硝酸銅溶液、硝酸鉀溶液及雙蒸水，使 混合溶液中硝酸銅濃度與目標(biāo)化合物濃度為0. 0001-0.0 Olmol/L(根據(jù)紫外滴定選擇二者 結(jié)合比最佳濃度），硝酸濃度為0. 〇〇lmol/L，離子強(qiáng)度為0. lmol/L硝酸鉀，溶液總體積為 25mL〇
[0226] 在25. 0±0. 1°C恒溫和氮?dú)獗Ｗo(hù)下用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，平行滴定至少三次，記 錄滴定結(jié)果。
[0227] 對實驗所得數(shù)據(jù)用Hyperquad軟件進(jìn)行擬合，分別得目標(biāo)化合物的質(zhì)子離解常數(shù) PKa和目標(biāo)化合物合銅配合物的逐級穩(wěn)定常數(shù)。在擬合中，物種及其熱力學(xué)參數(shù)設(shè)置是否合 理可通過實驗與理論滴定曲線重合程度進(jìn)行初步判斷，合理的結(jié)果要求估計誤差平方和的 最小二乘收斂，也可通過與文獻(xiàn)報道值比較進(jìn)行確認(rèn)。
[0228] 測定及擬合計算的每個化合物與Cu( II )離子穩(wěn)定常數(shù)結(jié)果如下表所示：
[0229]

[0230] 實驗結(jié)果分析：由上述結(jié)果可見實施例所選化合物在溶液中與銅離子螯合形成的 配合物的穩(wěn)定常數(shù)IogK均在17~20左右。除了以上6個化合物，其余的化合物對銅離子 也表現(xiàn)出了良好螯合性，其穩(wěn)定常數(shù)IogK也保持在17左右?？梢姳景l(fā)明所述縮氨脲類化 合物對銅離子具有良好的螯合性，形成的配合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。這為該系列化合物通過螯合銅 離子抑制SODl的酶活性及調(diào)控細(xì)胞中銅離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)提供了理論支持。因此可見本發(fā)明提 供的通式（I )所示系列化合物在治療銅代謝紊亂藥物研發(fā)中有良好的應(yīng)用前景。
[0231] 實施例23:
[0232] 優(yōu)選目標(biāo)化合物分別在溶液中和細(xì)胞內(nèi)對銅鋅超氧化物歧化酶（SODl)的抑制作 用試驗。應(yīng)注意，本實施例中所列舉的6例優(yōu)選化合物的實驗數(shù)據(jù)及結(jié)論僅作為驗證目的。
[0233] 1，實驗儀器及材料：
[0234] SpectraMax M5 型酶標(biāo)儀（美國 Molecular Devices 公司），純化的 SODl 蛋白，HT Superoxide Dismutase Assay Kit (Trevigen 公司）
[0235] 2,試驗方法：
[0236] 實驗原理：高通量SOD活性檢測試劑盒（WST法）測定SODl活性。WST法也是一 種間接的測定SOD活性的方法，本實驗中，黃嘌呤氧化酶（XOD)催化黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸和過 氧化氫的過程中產(chǎn)生O2'，O2 ·能使WST-ι轉(zhuǎn)變?yōu)閃ST-I甲攢，WST-I甲攢在450nm處有吸 收。同時SOD能催化02'歧化為H 202和0 2，從而降低WST-I甲攢的形成，WST-I甲攢減少的 程度可以間接衡量SOD的活性。處理數(shù)據(jù)時，實驗樣品的相對SOD活性依據(jù)抑制WST-I甲 攢牛成諫率的百分比"確宙吸光庠在4f50mi的奪化諫率，抑制率的計筧公式：
[0238] 螯合劑和SODl作用后測得的抑制率可根據(jù)此公式得出SODl的物質(zhì)的量，進(jìn)而算 出SODl的活力。
[0239] 細(xì)胞中的SODl活性測試與上述方法原理相同：用配制好的含有血清和雙抗的 DMEM培養(yǎng)基，在37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)Hela細(xì)胞。待細(xì)胞長到培養(yǎng)瓶的80-90%時，用 0. 25%胰酶消化細(xì)胞（約為2min)，用含有血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸，本實驗將細(xì)胞 鋪在六孔板中，每個孔中加入ImL細(xì)胞懸液，再加入ImL含有血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，混 勻，在37°C，5 % 0)2條件下繼續(xù)培養(yǎng)Hela細(xì)胞。用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，待每個孔內(nèi)貼 壁細(xì)胞達(dá)到80%左右，吸除原培養(yǎng)基，用IXPBS洗一遍，然后加入1980-2000 μ L新鮮的無 血清DMEM培養(yǎng)基，再向各孔中加入相同體積不同濃度的螯合劑，最終使終體積為2000 μ L。 設(shè)置對照孔，水溶的化合物加入等體積的滅菌水作為對照，DMSO溶的化合物加入等體積的 DMSO作對照（DMS0含量彡1 % )。每個樣品做3個平行樣，螯合劑和Hela細(xì)胞再作用24h。 倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況良好，螯合劑在培養(yǎng)基內(nèi)沒有析出，吸除原培養(yǎng)基，用 I XPBS洗一遍，每孔加入500 μ L0. 25 %胰酶消化細(xì)胞（約為2min)，然后將胰酶吸除，加入 ImL含有血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至I. 5mL EP管中，放置在冰上備用。細(xì) 胞裂解后，加入不同量的細(xì)胞裂解液，根據(jù)擬合公式算出抑制率，詳見表2。螯合劑和細(xì)胞作 用后，裂解細(xì)胞測得的抑制率可根據(jù)此公式得出SODl的活力，進(jìn)而算出SODl的相對活力。
[0240]表 2
[0243] 本發(fā)明所述的優(yōu)選化合物對細(xì)胞中SODl酶活性的半抑制濃度（IC5。）對比詳見圖 1。實驗結(jié)果分析：從實驗?zāi)繕?biāo)化合物對SODl活性抑制結(jié)果并結(jié)合化合物分子結(jié)構(gòu)分析可 以得知，本發(fā)明所述縮