TaHMA2基因啟動(dòng)子和第一內(nèi)含子調(diào)控基因表達(dá)的功能的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物啟動(dòng)子和內(nèi)含子領(lǐng)域，是關(guān)于一個(gè)具有組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子 序列和一個(gè)具有啟動(dòng)子活性并有組織表達(dá)特異性的內(nèi)含子序列，以及這兩個(gè)序列在植物轉(zhuǎn) 基因領(lǐng)域的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 鋅（Zn)是生物有機(jī)體所必需的微量元素之一，在眾多的生理過(guò)程中起重要作用。 近年來(lái)的研究表明，植物以及人體中的Zn缺乏現(xiàn)象是很多國(guó)家面臨的重大問(wèn)題(AlIoway, 2004 ：Hotz and Brown, 2004)，提高作物可食部位的Zn含量是解決人類(lèi)Zn影響缺乏的重 要途徑(Cakmak,2008)，因此明確Zn在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分配的分子機(jī)理有著重大的現(xiàn)實(shí)意 義。本專(zhuān)利涉及到的小麥TaHMA2蛋白就是一個(gè)具有跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)Zn、Cd的P 1B_type ATPase， 其基因是從高Zn小麥品種京冬8號(hào)中克隆得到的，含有8個(gè)內(nèi)含子，其中第一內(nèi)含子為 889bp (Tan et al. ,2013)。研究TaHMA2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是分析其蛋白Zn轉(zhuǎn)運(yùn)功能的 重要組成部分，這在通過(guò)植物基因工程來(lái)調(diào)控作物可食部位的Zn營(yíng)養(yǎng)或降低Cd毒害方面 具有重大意義。
[0003] 影響基因表達(dá)的因素表現(xiàn)在多個(gè)水平，如DNA水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯 水平、翻譯后加工等。啟動(dòng)子是指可被RNA聚合酶及一些反式作用因子特異識(shí)別并與之結(jié) 合，從而正確有效起始基因轉(zhuǎn)錄的一段特異DNA序列，它對(duì)基因的表達(dá)具有決定性的調(diào)控 作用。啟動(dòng)子一般包含兩個(gè)組成部分，一是核心啟動(dòng)區(qū)，是形成普遍轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)所需要的，包 括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和鄰近的TATA框等；二是決定基因轉(zhuǎn)錄特異性和活性的區(qū)域，一般包含多 個(gè)保守域，其種類(lèi)、拷貝數(shù)及在啟動(dòng)子的位置在不同啟動(dòng)子間存在較大差異。一般認(rèn)為，啟 動(dòng)子可分為組成型、誘導(dǎo)型和組織特異型三大類(lèi)。某些情況下，一種類(lèi)型的啟動(dòng)子往往兼具 其他類(lèi)型啟動(dòng)子的特征。組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)基因的表達(dá)不受時(shí)空和環(huán)境條件限制；誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子啟動(dòng)基因的表達(dá)受特殊環(huán)境信號(hào)（物理的、化學(xué)的或生物因素等）的誘導(dǎo)調(diào)控；組織 特異性啟動(dòng)子可調(diào)控基因在特定器官、組織或細(xì)胞中表達(dá)。
[0004] 真核生物基因經(jīng)常含有一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子，在mRNA成熟的過(guò)程中這些內(nèi)含子最 終都會(huì)被精確地剪切除去，這是真核生物基因表達(dá)的基本特征之一。約80%以上的植物基 因具有內(nèi)含子，其5'和3'剪接位點(diǎn)的共有序列分別為CAG :eHAAGU和GCM :G( " ： "為剪 切部位；下劃線表示高度保守的位點(diǎn)）(Lorkovic et al. ,2000)。前人研究表明，內(nèi)含子及 其從轉(zhuǎn)錄前體中被剪接復(fù)合體除去的過(guò)程影響mRNA代謝的整個(gè)過(guò)程，包括轉(zhuǎn)錄起始、5'端 加帽、3'端加 Poly(A)尾、翻譯和降解等(Le Hir et al. ,2003)。研究發(fā)現(xiàn)有的內(nèi)含子對(duì)基 因表達(dá)具有增強(qiáng)作用，植物中最早的相關(guān)報(bào)道是玉米Adhl基因的第一內(nèi)含子(Callis et al.，1987)，此后又發(fā)現(xiàn)了許多具有增強(qiáng)基因表達(dá)的其他植物基因內(nèi)含子，例如水稻Actl 基因 (McElrov et al. , 1990)、擬南芥 UBQ3, 10, 11 基因 (Norris et al. , 1993)和馬鈴薯 Sus3基因 (Fu et al. , 1995b)等的內(nèi)含子。研究認(rèn)為內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)作用與其在轉(zhuǎn)錄單 位內(nèi)的位置和取向有關(guān)，一般情況下，內(nèi)含子正向插入轉(zhuǎn)錄單位5'端是增強(qiáng)基因表達(dá)所必 需的(Clancy et al. , 1994 ：Mascarenhas et al.，1990)，但也有與增強(qiáng)子類(lèi)似的內(nèi)含子， 即其增強(qiáng)基因表達(dá)的功能與其在轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的位置和方向無(wú)關(guān)(Gidekel et al. ,1996 ;盥 先芝and吳乃虎，2001)。一般認(rèn)為，具有增強(qiáng)基因表達(dá)的內(nèi)含子可通過(guò)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率、穩(wěn) 定mRNA等方式來(lái)增強(qiáng)mRNA的積累，從而增強(qiáng)基因的表達(dá)水平(Clancy and Hannah, 2002 ： Rose and Beliakoff，2000)，此外單子葉棺物某因內(nèi)含子增強(qiáng)某因表達(dá)的能力往往高于 雙子葉植物。有研究表明，有些植物基因的內(nèi)含子可以影響基因的表達(dá)模式，例如馬鈴薯 sus3(Fu et al. ,1995b)和sus4(Fu et al. ,1995a)基因的內(nèi)含子均可影響其基因的表達(dá) 水平和組織表達(dá)模式。研究還發(fā)現(xiàn)，有的基因內(nèi)含子具有啟動(dòng)子活性，動(dòng)物中相關(guān)的報(bào)道較 多，而高等植物中則非常少，其中玉米Ubiquitin基因的第一內(nèi)含子（包括其較小的第一外 顯子）(Salgueiro et al. ,2000)和水稻 0stubl6 β-tubulin 基因的第一內(nèi)含子(Morello et al.，2002)詢具有啟動(dòng)子活件，目1詢含有TATA box和/或CAAT box。綜上所述，有些 植物基因的內(nèi)含子在基因表達(dá)過(guò)程中可能具有重要的啟動(dòng)和調(diào)控作用，值得深入分析。
[0005] 參考文獻(xiàn)
[0006] Alloway, B. J. (2004)Zinc in soils and crop nutrition. International Zinc Association, Brusselsl30.
[0007] Cakmak，I. (2008)Enrichment of cereal grains with zinc !Agronomic or genetic biofortification Plant Soil.302,1-17.
[0008] Cal I is, J. , Fromm, M. and ffalbot,V. (1987) Introns increase gene expression in cultured maize cells. Genes Dev.1,1183-1200.
[0009] Clancy, M. and Hannah, L. C. (2002) Splicing of the maize Shl first intron is essential for enhancement of gene expression, and a T-rich motif increases expression without affecting splicing. Plant Physiol. 130.918-929.
[0010] Clancy，M.，Vasil，V. ,Hannah，L. and Vasil，I. K. (1994)Maize Shrunken-lintron and exon regions increase gene expression in maize protoplasts.Plant Sci. 98. 151-161.
[0011] Fu, H. , Kim, S.Y.and Park, ff.D. (I 9 9 5 a) H i gh - I e v e I tuber expression and sucrose inducibility of a potato Sus4sucrose synthase gene requires^ and3^ flanking sequences and the leader intron.The PlantCell7. 1387-1394.
[0012] Fu, H. , Kim, S. Y. and Park, ff. D. (1995b) A potato Sus3sucrose synthase gene contains a context-dependents^ element and a leader intron with both positive and negative tissue-specific effects. The Plant Cell7. 1395-1403.
[0013] Gidekel, M. , Jimenez, B. and Herrera-Estrella, L. (1996)The first intron of the<i>Arabidopsis thaliana〈/i>gene coding for elongation factorlβ contains an enhancer-like element. Genel70,201-206.
[0014] Hotz，C. and Brown，K. H. (2004)Assessment of the risk of zinc deficiency inpopulations and options forits Control !International nutrition foundation ： for UNlL
[0015] Le Hir，H.，Nott，A. and Moore，M. J. (2003) How introns influence and enhance eukaryotic gene expression. Trends Biochem. Sci. 28. 215-220.
[0016] Lorkovic, Z. J. ,ffieczorek Kirk, D. A. , Lambermon, M. and Filipowicz, ff. (2000) Pre-mRNA splicing in higher plants. Trends inPlant Science5. 160-167.
[0017] Mascarenhas，D.，Mettler，I. J.，Pierce，D. A. and Lowe，H. W. (1990) Intron-mediated enhancement of heterologous gene expression in maize. Plant Mol. Biol. 15. 913-920.
[0018] McElroy，D.，Zhang，W.，Cao，J. and Wu，R. (1990) Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. The Plant Cell2. 163-171.
[0019] Morello，L.，Bardini，M.，Sala，F(xiàn). and Breviario，D. (2002) A long leader intron of the 0stubl6rice β -tubulin gene is required for high-level gene expression and can autonomously promote transcription both in vive and in vitro. PlantJ. 29, 33-44.
[0020] Norris，S. R.，Meyer，S. E. and Cailis，J. (1993)The intron of Arabidopsis thaiiana polyubiquitin genes is conserved in location and is a quantitative determinant of chimeric gene expression. Plant Mol. Biol. 21. 895-906.
[0021] Rose，A. B.and Beliakoff